恒奧德儀器紫外分光光度計儀器組成 測定方法

儀器組成

分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。

光譜范圍

包括波長范圍為400~760 nm的可見光區和波長范圍為200～400 nm的紫外光區。不同的光源都有其*的發射光譜,因此可采用不同的發光體作為儀器的光源。

分光光度計圖片

分光光度計圖片(4張)

鎢燈的發射光譜:鎢燈光源所發出的400～760nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后,可得到由紅橙，黃綠，藍靛，紫組成的連續色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源。

氫燈（或氘燈）的發射光譜:氫燈能發出185～400 nm波長的光譜可作為紫外光光度計的光源。

蛋白質的直接定量（UV法）

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，測試空白液，然后直接測試蛋白質。由于緩沖液中存在些雜質，般要消除320nm 的“背景”信息，設定此能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發現讀數“漂移”。這是個正常的現象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不過1%，表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以定的系數，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較。

比色法蛋白質定量

蛋白質通常是多種蛋白質的混合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關，從而反應蛋白質濃度。

測定方法

比色方法

般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。

Lowry 法：以早期的Biuret 反應為基礎，并有所改。蛋白質與Cu2 反應，產生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質的蛋白不適合此種方法。

BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：這是種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應產生Cu ，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系較強，反應后形成的化合物非常穩定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。

Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰595nm。其大的特點是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡單，速度更快；只需要種反應試劑；化合物可以穩定1小時，方便結果；而且與系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。主要的缺點是不同的標準品會導致同樣品的結果差異較大，無可比性。