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擔(dān)心PCR擴增的影響?來看自動化PCR-Free解決方案

來源:貝克曼庫爾特國際貿(mào)易(上海)有限公司   2023年03月10日 10:19  

常規(guī)高通量測序的文庫構(gòu)建,需要PCR擴增。主要是為了對微量DNA樣本進行擴增,提高庫容;另一方面,放大核酸熒光信號,提高測序準確度。然而,PCR擴增同樣也有著無法忽視一些問題:

1.      擴增過程中產(chǎn)生復(fù)制錯誤,累積下去,產(chǎn)生假陽性;

2.      擴增會有一定的偏好性,比如GC含量異常的區(qū)域和二級結(jié)構(gòu)等區(qū)域,擴增效率低,難以覆蓋;

3.      擴增的循環(huán)數(shù)越多,重復(fù)率(Duplication)越高,造成測序成本增加、浪費測序數(shù)據(jù)。

什么是PCR-Free技術(shù)

常規(guī)擴增建庫有諸多問題,那么PCR-Free技術(shù)也就營運而生。PCR-Free技術(shù),相較于常規(guī)建庫,其建庫步驟為:基因組片段化-末端修復(fù)-加接頭-純化-文庫質(zhì)控,省去了PCR擴增的步驟。

1.      PCR-Free建庫技術(shù):

2.      省去擴增步驟,縮短建庫時間;

3.      避免使用高保真聚合酶,降低建庫成本;

4.      減少擴增產(chǎn)生的復(fù)制錯誤;

5.      避免擴增偏好性;

6.      避免擴增產(chǎn)生的Duplication,降低測序成本。

llumina DNA PCR-Free Prep,Tagmentation DNA建庫即運用了PCR-free的建庫方式,并同時采用創(chuàng)新型鏈接在磁珠上的轉(zhuǎn)座酶(BLT),將接頭連接和DNA 片段化結(jié)合到一個簡單快速的反應(yīng)中,實現(xiàn)WGS高度均勻的覆蓋。

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針對PCR-Free建庫方法,我們推出了基于Biomek i7工作站的Illumina DNA PCR free文庫構(gòu)建自動化方案,該方案可使用低投入量(25-99ng)或標準投入量(100-2000nggDNA進行建庫,同時進行96例樣本的建庫。

·        減少手動操作時間

·        減少系統(tǒng)設(shè)置何潛在的移液錯誤

·        標準化工作流程改進實驗結(jié)果

·        快速安裝

Biomek i7工作站

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1. Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation工作桌面

·        集成了96通道移液頭與靈活8通道移液頭;

·        靈活8通道可配置固定針和可替換吸頭通道搭配;

·        96通道可選擇上一列、一行、多行等不規(guī)則形狀排列吸頭,實現(xiàn)不定樣本數(shù)液體轉(zhuǎn)移;

·        斜側(cè)抓板機械手可360度旋轉(zhuǎn),輕松實現(xiàn)臺面全覆蓋;

·        多達45個工作板位;

·        可實現(xiàn)震蕩、加熱/冷卻、吸頭清洗等功能;

·        開放式工作桌面,可輕松整合外部設(shè)備,如(自動PCR儀)。

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2. Illumina PCR free DNA Library Prep 自動化工作流

使用Biomek i7工作站進行 Illumina PCR free文庫構(gòu)建,輕松解放雙手,把更多的活交給工作站來進行

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1.  Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation自動化Illumina PCR free流程預(yù)估時間(大于100ng gDNA投入)

Method Options Selector (MOS

MOS能夠選擇樣本數(shù)量、投入量、Index開始使用位置,以最大限度地提高靈活性、適應(yīng)性和方法執(zhí)行的簡易性。

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3. Illumina PCR-Free建庫方法選項選擇器

Guided Labware Setup (GLS)

GLS基于MOS中選擇的選項生成的,并提供用戶特定的圖形設(shè)置說明,包括試劑體積計算和準備試劑的分步說明。

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4. 引導(dǎo)式實驗室設(shè)置提供配方注釋,指示試劑量(上圖),

并指導(dǎo)用戶正確設(shè)置平臺(下圖)

DeckOptixFinal Check (DFC)

在開始運行自動化流程之前,BML中的DFC功能,會通過實時拍照的方式分析工作桌面耗材擺放,以減少設(shè)置錯誤,例如吸頭、深孔板擺放位置錯誤。

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實驗設(shè)計

為了證明在i7雙雜交工作站上進行96個樣品文庫制備的能力,我們從人細胞系NA12878 gDNA制備文庫。將起始濃度為150 ng、300 ng、400 ng500 ng750 ng48gDNA樣本以及陰性模板對照(NTC)隨機放入96孔板,如下所示。

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實驗結(jié)果

·        隨機挑取了23 gDNA文庫進行測序,平均插入片段為483bp±28bp

·        Reads mapping率為96.8%,標準偏差為0.1%

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Biomek i7工作站上的Illumina  PCR free DNA文庫制備自動化是一個獨立的解決方案,為任何規(guī)模的實驗室提供了高效、靈活和可擴展的解決方案。自動化解決方案提供的文庫在下游工作流程中產(chǎn)生高質(zhì)量的結(jié)果,并節(jié)省了寶貴的時間和金錢。



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