免疫吸附分析 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA試劑是以體外抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原抗體特異性反應(yīng)與酶的高效催化作用相結(jié)合的一種檢測方法，靈敏度可達(dá)皮克(pg/mL)水平。它是目前商業(yè)應(yīng)用為成熟的免疫分析方法之一，在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)、臨床診斷、生物制藥方面的運(yùn)用也極為廣泛。目前，常見的ELISA類型有四種：雙抗夾心法、直接法、間接法和競爭法。

其中，雙抗夾心法是為常用的一種，分雙抗體夾心和雙抗原夾心。下面小科將以雙抗體夾心法為例，和大家分享相關(guān)知識(shí)~

實(shí)驗(yàn)原理：

雙抗體夾心法，其基本原理是將定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待檢標(biāo)本，通過加入檢測抗體，酶標(biāo)記第二抗體后用TMB底物顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈正相關(guān)。

1 包被抗體

許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等，在進(jìn)行抗體固定化之前，需要對(duì)酶標(biāo)板材進(jìn)行篩選。酶標(biāo)板由親水到疏水，對(duì)蛋白的結(jié)合會(huì)由強(qiáng)變?nèi)酰斐晌侥芰Φ牟町悺⒖贵w吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好，吸附時(shí)一般要求pH在9.0～9.6之間。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進(jìn)行滴定：用不同的蛋白質(zhì)濃度包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽性標(biāo)本OD值，選擇OD值大而蛋白量少的濃度。

2 標(biāo)準(zhǔn)品及樣本

標(biāo)準(zhǔn)品即為目標(biāo)物（樣本中待檢測因子）的純蛋白，從母液稀釋到稀釋都需要特別留意，標(biāo)曲的制作是ELISA實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。待檢目標(biāo)物需具備多個(gè)抗原表位，即二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，因?yàn)檫@種檢測方法需要兩種抗體。另外，需要注意的是血清樣本中的類風(fēng)濕因子（RF）干擾——RF能與多種動(dòng)物的變性IgG的Fc部分結(jié)合而產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。

3 洗滌液

ELISA操作中會(huì)涉及到多次洗板。長時(shí)間的孵育后，會(huì)出現(xiàn)非特異性結(jié)合，這時(shí)就需要洗滌液來洗去非特異性結(jié)合的蛋白或抗體，通常為PBS，洗4-6次，每次30s左右。多次短時(shí)間洗板比少次長時(shí)間洗板更有效，在后一次洗板時(shí)，盡量拍凈液體，同時(shí)注意讓板子保持濕潤。

4 檢測抗體

雙抗體夾心法中的檢測抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合位點(diǎn)需要有別于目標(biāo)物與包被抗體結(jié)合的位點(diǎn)，即會(huì)涉及抗體配對(duì)的問題。常用的抗體配對(duì)方法有下幾種：

包被抗體為單抗，檢測抗體為多抗；

包被抗體為單抗，檢測抗體為單抗，但這兩種單抗針對(duì)的抗原表位不同；

包被抗體為多抗，檢測抗體為多抗，這兩種多抗一般來源于不同的宿主。

5 生物素標(biāo)記的二

鑒于酶標(biāo)二抗的局限性，現(xiàn)在廠家一般引入生物素親和素系統(tǒng)(biotin avidin system, BAS)，這種系統(tǒng)在提高反應(yīng)靈敏度的同時(shí)，應(yīng)用起來也更加方便。進(jìn)行生物素標(biāo)記時(shí)，可依據(jù)抗體所帶可標(biāo)記基團(tuán)種類（氨基、醛基、巰基等）以及分子酸堿性選擇相應(yīng)的活化生物素和反應(yīng)條件。生物素標(biāo)記后，不影響被標(biāo)記物的生物活性。

6 辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素

每個(gè)親和素分子可與4個(gè)生物素分子結(jié)合，所以可以偶合更多連接生物素的酶分子，從而大大提高了ELISA實(shí)驗(yàn)的靈敏度。生物素和親和素間的親和力強(qiáng)，二者一旦結(jié)合，就極為穩(wěn)定，而且這種結(jié)合反應(yīng)時(shí)間比抗原抗體反應(yīng)所需時(shí)間短。在BAS檢測中多用鏈霉親和素“streptavidin, SA”，它是鏈霉菌培養(yǎng)過程中的分泌物，由4條相同的肽鏈組成。HRP靈敏，穩(wěn)定，比活性高，分子量小，純酶容易制備。其有4對(duì)半胱氨酸形成的二硫鍵，99位Asp和123位Arg形成的鹽橋，9個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，有兩個(gè)金屬中心，可催化顯色底物TMB產(chǎn)生藍(lán)色一價(jià)物。

7 顯色底物

由于 TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）比其他顯色底物具有更高的靈敏度且無致癌性、故而被廣泛使用。HRP 或其他適當(dāng)過氧化物酶能在過氧化氫存在下催化TMB生成可溶的藍(lán)色物，此時(shí)通常可在 370nm 測定吸光度。當(dāng)顯色反應(yīng)被酸性溶液終止后，產(chǎn)物由藍(lán)色一價(jià)物轉(zhuǎn)為二價(jià)物，此時(shí)可在 450nm 測定吸光度。

實(shí)驗(yàn)步驟概要：

準(zhǔn)備好所有的試劑和梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。板條加入300μl 1×洗液靜置浸泡30秒。

標(biāo)準(zhǔn)品孔加入100μl 2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。血清/血漿：空白孔加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液; 細(xì)胞培養(yǎng)上清: 空白孔加入100 μl培養(yǎng)基。

血清/血漿：樣本孔加入50μl 1×檢測緩沖液和50μl 樣本 細(xì)胞培養(yǎng)上清：樣本孔加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)上清。

每孔加入50μl 1:100稀釋的檢測抗體。步驟2、3、4 在15分鐘內(nèi)完成。

封膜，室溫孵育2小時(shí)。洗滌6次。

每孔加入100μl 1:100稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。

封膜，室溫孵育45分鐘。洗滌6次。

每孔加入100μl顯色底物，避光，室溫孵育5 - 30分鐘。

每孔加入100μl終止液。

30分鐘內(nèi)，在450nm波長檢測OD值，參考波長570nm或63nm

注：以上步驟是研域生物ELISA試劑盒為參考，不同廠家的試劑盒操作步驟可能不一樣，開始實(shí)驗(yàn)前一定要仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說明書哦~！