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ELISA試劑盒實驗操作的影響

來源:上海撫生實業有限公司   2023年02月28日 15:11  

   ELISA測定中影響因素較多,操作過程中每個環節都會對試驗結果產生影響,出現錯誤的結果。以下是ELISA試驗操作中的影響因素:
1、加樣
     孵育前加樣時間過長,酶試劑加出孔外,使用滴瓶滴加試劑時,滴加的角度不同和擠壓的力度不同,致使滴加的試劑量不準,都可導致試驗結果不準確。控制方法:

①實驗樣本過多時,可分批次操作,以減少實驗時間延長造成的誤差;

②加酶試劑后,用吸水紙吸干孔外試劑;

③作定量試驗時,使用加樣器加注試劑,并經常校正其準確性,此外,要做到一份樣本一個移液頭,防止交叉污染。

2、溫育
       溫育是ELISA測定最為關鍵、最容易出現問題的步驟。最為常見的溫育溫度有37℃和室溫,其次是43℃和2-8℃。目前國內售ELISA試劑盒溫育時間為37℃,30 min-1 h,進口ELISA試劑盒則通常為37℃,1-2 h能有較wan全的結合。
1)、溫育時間、溫度的選擇一般根據試劑盒的說明書選擇溫育的時間、溫度。
      加完樣本和(或)試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時,孔內溫度從室溫升至37℃需要一定時間,如果是將微孔板一放入溫箱即開始計時,這樣就容易造成實際測定中溫育時間不夠,易致弱陽性標本測不出來。控制方法:①如有兩種溫度,盡量使用較低的溫育溫度、較長反應時間的條件;②用1個小溫度計放置在板孔反應液中測量觀察。
2)、“邊緣效應”的排除“邊緣效應”是在使用96孔板的ELISA測定中,外周孔顯色較中心孔深的現象。產生的原因可能是為96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學梯度造成的,因此在溫育時盡量采用水浴。

3、洗板
       ELISA測定的洗板一般有兩種方式,即手工和洗板機洗板。采用手工洗板,孔與孔之間液體易交叉,采用半自動洗板機時,洗液量不足導致洗板不徹di,洗板針堵塞導致抽吸不wan全,洗板不暢導致清洗效果差。控制方法:
     ①手工洗板時,拍板時要垂直,避免交叉污染,用力不能過猛,防止抗原抗體復合物脫離;
     ②洗板機洗板時應經常檢查沖洗頭是否通暢,若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出;
     ③為了洗滌效果好,實驗室可采用機器與人工洗滌相結合的方法,在機器洗滌后再進行人工洗板1-2次,或適當增加洗板的次數,有資料報道洗板7次能達到理想的洗滌效果[5]

4、顯色
      市售ELISA試劑盒中,如以四甲基聯苯胺(TMB)為底物,則提供的底物為A和B兩瓶應用液;如以鄰苯二胺(OPD)為底物,則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑。顯色反應條件為37℃或室溫反應15-30 min。以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑,要臨用前30 min配制且必須避光。以四甲基聯苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光,但A、B液應盡量避免接觸金屬器械。

5、結果判定
      讀取結果要在15-30 min內完成,定性測定用肉眼判讀試驗結果時,反應板應水平距離白色背景10-15 cm;定量測定時用酶標儀讀取結果,酶標儀不應置于陽光或強光照射下,需先預熱15-30 min再進行測試。
      綜上所述,盡管ELISA法操作簡單,但可能影響測定結果的因素也較多。故在實際操作的過程中,要加強質量管理,認真避免或減少影響因素,力求結果準確,為疾病的診斷和科研提供可靠的依據。

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