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激光共焦顯微鏡是一種高科技顯微鏡;它是在熒光顯微鏡成象的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發熒光探針，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像，成為形態學、分子細胞生物學、神經科學、藥理學、遺傳學等領域新一代強有力的研究工具。
在普通寬視野光學顯微鏡中，整個標本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線照明，圖像可以用肉眼直接觀察。 同時，來自焦點以外的其他區域的熒光對結構的干擾較大，尤其是標本的厚度在 2um 以上時，其影響更為明顯。
激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經照明針孔，經由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描。
組織樣品中如果有可被激發的熒光物質，受到激發后發出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管(PMT)探測收集，并將信號輸送到計算機，處理后在計算機顯示器上顯示圖像 。
在這個光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小孔。因此，非觀察點的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。
由于照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，即共聚焦。
以激光作光源并對樣品進行掃描，在此過程中兩次聚焦，故稱為激光共焦顯微鏡。
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