MB50271.1 v.A

    細(xì)胞β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase）活性比色法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

    細(xì)胞β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物PNP-NAG受到β氨基己糖苷酶催化水解后，在堿性環(huán)境下，呈現(xiàn)黃色，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物和人體細(xì)胞裂解懸液樣品中β氨基己糖苷酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase；EC3.2.1.52）.又稱為N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl--β-D-Glucosaminidase；NAGase）屬于含有20個糖苷水解酶（glycoside hydrolase）家族，也是肽聚糖水解酶，為溶酶體細(xì)胞器中的酶之一。其功能在于水解N-乙酰-β-D-氨基己糖苷中的末端N-乙酰-β-D-氨基己糖殘基（N-acetyl-D-hexosamine   residues），參與細(xì)胞內(nèi)糖蛋白和糖脂的分解代謝，包括蛋白和中性糖脂中的寡糖、粘多糖等水解。具有宿主抗感染防御作用。β氨基己糖苷酶為同源二聚體結(jié)構(gòu)，有α和β兩個亞體構(gòu)成：HEXA和HEXB。人體缺乏HEXA或HEXB，將導(dǎo)致神經(jīng)退行性相關(guān)的疾病，例如家族黑蒙性病（Tay-Sachs病）和神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病  （Sandhoff 病）。 基于底物4-硝基苯基 N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide；PNP-NAG），在β氨基己糖苷酶的作用下，水解釋放出硝基苯酚（p-nitrophenol）和N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（N-acetyl-β-D-glucosamine；NAG），在堿性環(huán)境下，呈現(xiàn)出黃色，在分光光度儀下，產(chǎn)生吸光峰值變化（405nm 波長），來定量分析β氨基己糖苷酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

    緩沖液（Reagent A）         毫升

    反應(yīng)液（Reagent B）         毫升

    堿性液（Reagent C）           毫升

    陰性液（Reagent D）           微升

    清理液（Reagent E）         毫升

    裂解液（Reagent F）         毫升

產(chǎn)品說明書               1份

保存方式

保存    反應(yīng)液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于比色分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實驗步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升    清理液（Reagent E），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升    清理液（Reagent E），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升    裂解液（Reagent F），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用     Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解萃取懸液樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零

3．     緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

三、 背景對照測定

1． 移取xx微升    緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx微升    反應(yīng)液（Reagent B）

3． 加入xx微升    陰性液（Reagent D）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育10分鐘

6． 加入xx微升    堿性液（Reagent C）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻

8． 在37℃溫度下孵育5分鐘

9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照

四、 樣品測定

1． 移取xx微升    緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx微升    反應(yīng)液（Reagent B）

3． 加入50微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH小于7.5）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育10分鐘

6． 加入xx微升    堿性液（Reagent C）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻

8． 在37℃溫度下孵育5分鐘

9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù) 

四、計算樣品活性

五、 酶標(biāo)儀測定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品

2． 分別移取xx微升    緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔里

3． 分別加入xx微升    反應(yīng)液（Reagent B）

4． 分別加入xx微升    陰性液（Reagent D）或待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH小于7.5）

5． 輕輕搖動96孔板

6． 在37℃溫度下孵育10分鐘

7． 分別加入xx微升    堿性液（Reagent C）

8． 輕輕搖動96孔板

9． 在37℃溫度下孵育5分鐘

10． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測 

11． 活性計算

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 樣品須澄清，至關(guān)重要

5． 建議使用比色皿測定

6． 加樣后3秒內(nèi)比色測定

7． 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)10分鐘

8． 比色測定后，比色皿須清洗

9． 樣本測定10分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供      Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

11． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

12． β氨基己糖苷酶單位活性定義為：在37℃，pH 4.25條件下，每分鐘內(nèi)能夠釋放1微摩爾硝基苯酚所需的酶量作為一個活性單位

13． 本公司提供系列細(xì)胞酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感