精子頂體形態豌豆凝集素熒光標記（PSA-FITC）染色試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

 精子頂體形態豌豆凝集素熒光標記（PSA-FITC）染色試劑是一種旨在使用熒光素標記的豌豆凝集素和赫斯特33258雙重熒光染色技術，分析生理性反應性或病理性退行性頂體缺失的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種動物（例如猴、豬等）或人體精子細胞以及凍存精子細胞，包括睪丸中、附睪中以及射精后的精子細胞的頂體狀態。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡便，性能穩定，熒光清晰。

技術背景

在男科學（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子壽命、以及生育能力的基礎信息。其中精子的活力（vitality）、運動能力（motility）、授精潛力（fertilizing potential）、膜結構或染色質結構完整性（integrity）、頂體反應（acrosomal reaction）功能的評價是精子分析的重要指標，也是決定人工受孕或體外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要參數。其中頂體反應，是指當精子接近卵子實施授精時，精子頭部前半端的帽狀結構頂體，釋放出溶解酶，以便精子和卵子的膜融合。頂體反應測試是一項穩定的精子功能參數，可以用于預測受精成功率。因此頂體的結構完整性（intact）是評價的主要標志，也是不育癥和避孕藥物研究的對象。使用熒光素標記的無毒性的豌豆凝集素（Isothiocyano fluoresceinated pisum sativum agglutinin；PSA-FITC）和赫斯特33258（Hoechst 33258）雙重熒光染色技術，是精子頂體反應分析和授精效率評價的的方法。首先使用赫斯特33258染色，分析精子活力，基于赫斯特33258具有有限的膜通透性特點，受到活體精子細胞（包括游動性和非游動性精子）的排斥，而容易進入死亡精子細胞。其次使用熒光素標記的豌豆凝集素染料，與頂體基質（matrix）上糖蛋白頂體素原（proacrisin）上的半乳糖或甘露糖糖基（sacchride residue）的反應，顯示完整性（未反應性unreacted）頂體。雙染的作用，以幫助區分生理性反應性頂體缺失（loss）或病理性退行性頂體缺失。通過常用的熒光顯微鏡（激發波長488nm，散發波長530nm）便可清晰觀察到綠色頂體狀態（status）。  

產品內容

 保存液（Reagent A）           50毫升

 染色液A（Reagent B）         250微升

 清理液（Reagent C）           30毫升

 固著液（Reagent D）            5毫升

 染色液B（Reagent E）           4毫升

產品說明書               1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里； 染色液A和B（Reagent B和E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于樣品染色操作的容器

血細胞計數器：用于細胞計數

載玻片和蓋玻片：用于精子細胞爬片

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察染色的精子細胞

實驗步驟

1． 移取新鮮獲得的1毫升精液（48小時內）到1.5毫升離心管

2． 放進37℃培養箱孵育30分鐘

3． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1000RPM，例如EPPENDORF 5415）

4． 小心抽去上清液

5． 加入1毫升 保存液（Reagent A），混勻顆粒群

6． 在血細胞計數器上進行精子細胞計數，并調整到2 X 10⁷精子細胞/毫升

7． 移取100微升精子細胞到新的1.5毫升離心管

8． 加入10微升 染色液A（Reagent B），混勻

9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照

10． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1000RPM，例如EPPENDORF 5415）

11． 小心抽去上清液

12． 加入500微升 清理液（Reagent C），混勻顆粒群

13． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1000RPM，例如EPPENDORF 5415）

14． 小心抽去上清液

15． 重復實驗步驟12至14一次

16． 加入100微升 保存液（Reagent A），混勻顆粒群

17． 即刻移取20微升到潔凈的載玻片一端

18． 用蓋玻片或另一個載玻片推片

19． 置于空氣中涼干

20． 加上200微升預冷的 固著液（Reagent D），覆蓋樣品表面

21． 室溫下孵育1分鐘

22． 小心抽去固著液

23． 小心加上200微升 染色液B（Reagent E），覆蓋樣品表面

24． 室溫下孵育20分鐘，避免光照

25． 小心抽去染色液

26． 小心加上200微升 清理液（Reagent C），覆蓋樣品表面

27． 小心抽去清理液

28． 蓋上蓋玻片或封片液

29． 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察并計數（注意：每個視野計數200個精子）

觀察藍色熒光— 染色液A（Reagent B）：濾波器激發波長350nm，散發波長460nm ――可見藍色熒光，表明死亡精子細胞

觀察綠色熒光— 染色液B（Reagent E）：濾波器激發波長490nm，散發波長530nm ――可見綠色熒光，表明精子頂體區域

30． 分析結果

注意事項

1． 本產品為20次操作

2． 本產品可以與各種免疫抗體進行雙染

3． 本產品不適合分析精卵細胞反應的頂體狀態

4． 操作時須戴手套

5． 樣品檢測前，建議在血細胞計數器上進行精子細胞計數

6． 精子細胞計數時乘上稀釋倍數10⁴。標準血細胞計數器（Hemocytometer）的計算方法是：

1毫米方塊的細胞計數X 10⁴（稀釋倍數）＝實際細胞數/毫升

7． 染色完成后，即刻進行檢測分析

8． 用戶可以使用鈣離子載體A23187或Ionomycin誘導精子頂體缺失

9． 完整頂體（intact/whole acrosome）參考圖像如下：

10． 頂體赤道部分（Equatorial segment）參考圖像如下：

11． 本公司提供系列發育生物學相關檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定熒光清晰