負壓微環境對人臍靜脈血管內皮細胞 新生的影響及其機制

  本文亮點：

        (1) 利用自主研發的全自動三維細胞梯度負壓加載裝置，對人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）進 行間歇負壓吸引，觀察到體外負壓處理可顯著促進 HUVEC 的增殖、遷移與成管。

        (2) 推測對 HUVEC 的負壓刺激可能通過上調熱休克蛋白 90 的表達 ，抑制窖蛋白 1 與內皮型 NOS （eNOS）的結合 ，解除窖蛋白 1 對 eNOS 磷酸化位點 1177 的抑制以激活 eNOS，從而促進 HUVEC 新生。

        【摘要】 目的 探究負壓微環境對人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）新生的影響及其機制。

             方法 采用實驗研究方法。取第 3~5 代對數生長期 HUVEC 進行后續實驗。取 3 批細胞，各批次細胞 均分為常規培養 24 h 的正常對照組和單純負壓處理組以及加入 17-丙烯胺基-17-去甲氨基格爾德霉 素（17-AAG）培養 24 h 的單純 17-AAG 組與 17-AAG+負壓處理組，另采用自行設計研發的全自動三維 細胞梯度負壓加載裝置對 2 個負壓處理組細胞行持續 8 h 的間歇負壓吸引（負壓值為?5.33 kPa，吸引 30 s、暫停 10 s），第 1 個批次細胞處理完成后于培養 0（即刻）、24、48、72 h，采用細胞計數試劑盒 8 法檢 測細胞增殖水平，樣本數為 6；第 2 個批次細胞處理完成后進行劃痕試驗，于劃痕后 12 h，在倒置相差 顯微鏡下觀察細胞遷移情況后計算細胞遷移率，樣本數為 3；第 3 個批次細胞處理完成后進行小管形 成實驗，于培養 6 h，在倒置相差顯微鏡下觀察成管情況后計算細胞成管總長度與分支節點數，樣本數 為 3。取細胞，分為正常對照組、單純負壓處理組、17-AAG+負壓處理組，同前相應組別進行處理，處 理完成后，采用蛋白質印跡法檢測細胞中熱休克蛋白 90（HSP90）、窖蛋白 1、內皮型一氧化氮合酶 （eNOS）、eNOS 磷酸化位點 1177 蛋白表達并計算 eNOS 磷酸化位點 1177/eNOS 比值（樣本數為 3），采用 免疫共沉淀（共沉淀 HSP90 與窖蛋白 1、窖蛋白 1 與 eNOS）與蛋白質印跡法檢測各組細胞中窖蛋白 1、 eNOS 的蛋白表達（樣本數為 3），采用免疫熒光雙重染色法評估細胞中 HSP90 與窖蛋白 1、窖蛋白 1 與 eNOS 的蛋白共定位情況。通過 HADDOCK 2.4 蛋白質-蛋白質對接程序對窖蛋白 1 和 eNOS 進行分子 對接預測。數據分析采用析因設計方差分析、單因素方差分析、LSD 法。 結果 與正常對照組相 比，單純 17-AAG 組細胞增殖水平于處理完成后培養 24、48、72 h 均明顯降低（P<0.01），單純負壓處理 組 細 胞 增 殖 水 平 于 處 理 完 成 后 培 養 24、48、72 h 均 明 顯 升 高（P<0.01）；與 單 純 17-AAG 組 相 比 ， 17-AAG+負壓處理組細胞增殖水平于處理完成后培養 48、72 h 均明顯升高（P<0.05 或 P<0.01）；與單 純負壓處理組相比，17-AAG+負壓處理組細胞增殖水平于處理完成后培養 24、48、72 h 均明顯降低 （P<0.01）。劃痕后 12 h，與正常對照組的（39.9±2.7）%相比，單純 17-AAG 組細胞遷移率明顯降低 ［（10.7±2.7）% ，P<0.01］，單 純 負 壓 處 理 組 細 胞 遷 移 率 明 顯 升 高［（61.9±2.4）% ，P<0.01］；與 單 純 17-AAG 組相比，17-AAG+負壓處理組細胞遷移率明顯升高［（37.7±3.7）%，P<0.01］；與單純負壓處理

   本實驗研究旨在探討負壓處理對人臍靜脈血 管內皮細胞（HUVEC）新生的影響，并從 HSP90、窖 蛋白 1、eNOS 等分子水平闡明其機制，為臨床治療 慢性創面提供新的參考。

     討論

     在臨床中，NPWT 被廣泛應用于皮膚移植后固 定［17］ 、皮瓣修復術后創面封閉［18］ 、燒傷創面清創［19］ 、 下肢軟組織重建術后創面封閉［20］ ，同時也是下肢靜 脈性潰瘍創面［21?22］ 、糖尿病足潰瘍［23?24］ 、壓瘡［25］ 、術后 切口愈合不良［26］ 等難愈性創面的重要治療手段。 但是，目前對于 NPWT 在創面愈合中的作用及其機 制尚缺乏全面的認知。體外負壓梯度模擬機可以 對體外培養的細胞施加負壓作用，從而有助于深入 研究負壓促進創面愈合的機制。因此，本課題組自 行設計研發全自動三維細胞梯度負壓加載裝置，并 基于此構建 NPWT 在細胞中應用的離體模型。本課 題 組 先 進 行 了 SD 大 鼠 全 層 皮 膚 缺 損 創 面 應 用 NPWT 的預實驗，結合數字散斑技術，獲取負壓值與 創面位移量化所得形變量的對應關系，在此基礎 上，設計體外細胞負壓加載裝置，通過激光測距裝 置轉換并且控制壓力。