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追蹤PCR實驗中污染源

來源:上海撫生實業有限公司   2023年02月10日 14:08  

如果不慎發生污染情況,應從下面幾條出發,逐一分析,排除污染。

1.設立陰陽性對照:有利于監測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時,應選擇擴增弱,且重復性好的樣品,因強陽性對照可產生大量不必要的擴增序列,反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質粒為對照,100個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重,因為PCR敏感性ji 高,可以從其它方法(Sourthern 印跡或點雜交等)檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外,每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機對照,即包括PCR反應所需的全部成分,而不加模板DNA,這對監測試劑中PCR產物殘留污染是非常有益的。如果擴增結果中試劑對照為陽性結果,就是某一種或數種試劑被污染了。此時,要全部更換一批新的試劑進行擴增,擴增時設立不同的反應管,每一管含有一種被檢測試劑,在檢出污染試劑后,應馬上處理。


2.環境污染:在排除試劑污染的可能性外,更換試劑后,若不久又發現試劑被污染了,如果預防措施比較嚴密,則考慮可能為環境污染。環境污染中常見的污染源主要有:

(1)模板提取時真空抽干裝置。

(2)凝膠電泳加樣器。

(3)電泳裝置。

(4)紫外分析儀。

(5)切膠用刀或手術刀片。

(6)離心機。

(7)冰箱門把手,冷凍架,門把手或實驗臺面等。此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源:

(a)用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源。(b)0.1ml去離子水浸泡。(c)取5ml做PCR實驗。(d)電泳檢測結果。

(8)氣溶膠。

如果經過上述追蹤實驗,仍不能查找到確切污染源,則污染可能是由空氣中PCR產物的氣溶膠造成的,此時就應該更換實驗場所,若條件不允許,則重新設計新的引物(與原引物無相關性)。


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