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細(xì)菌呼吸鏈復(fù)合物3(bc-1 complex)活性光度法定量檢測試劑盒說明書

來源:上海銘博生物科技有限公司   2023年02月08日 11:01  

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 細(xì)菌呼吸鏈復(fù)合物3bc-1 complex)活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

(中文版)

主要用途

 細(xì)菌呼吸鏈復(fù)合物3bc-1 complex)活性光度法定量檢測試劑是一種旨在使用還原性合成輔酶Q同功類似物和特異性抑制劑,通過反應(yīng)系統(tǒng)測定樣品中細(xì)胞色素C還原后峰值的增高,即采用比色法測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的其適合于各種野生、培養(yǎng)或病原性細(xì)菌膜蛋白懸液樣品的輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶的特異性活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶,嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定,反應(yīng)優(yōu)化,檢測敏感。

技術(shù)背景

細(xì)菌呼吸鏈復(fù)合物III,通常稱為輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶、細(xì)胞色素還原酶或bc1復(fù)合物ubiquinol cytochrome c oxidoreductasecytochrome reductasebc1 complex),是細(xì)菌電子傳遞鏈的中心元素,位于革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌(除大腸桿菌和古生菌等),包括光合成細(xì)菌的細(xì)胞膜上,為寡聚體膜蛋白復(fù)合物。細(xì)菌使用氧氣、氮、硫化物等作為終端電子受體。細(xì)菌復(fù)合物III含有三個亞單位,包括細(xì)胞色素bCytochrome b),細(xì)胞色素c1cytochrome c1)和Rieske鐵硫蛋白Rieske iron-sulfur protein,通過Q循環(huán)(Q cycle)進(jìn)行催化作用。其特征性的酶活性是抗霉素敏感的輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶。復(fù)合物III催化氧化型細(xì)胞色素C被還原為還原型細(xì)胞色素C,細(xì)菌內(nèi)電子由低電位的供體還原型泛醌(ubiquinolUQH2)或還原型輔酶Qreduced Coenzyme QCoQH2)傳遞到細(xì)胞色素C或質(zhì)體藍(lán)素(plastocyanin)上的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng),進(jìn)行呼吸鏈傳遞。細(xì)菌復(fù)合物3和復(fù)合物4的相互作用,形成泛醌氧化酶(quinol oxidase輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶反應(yīng)系統(tǒng)測定氧化型細(xì)胞色素C的濃度變化。基于還原型泛醌或還原型輔酶Q底物,在抗霉素存在與否的情況下,通過輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶的催化,轉(zhuǎn)化成泛醌(ubiquinoneUQ)或輔酶QCoenzyme QCoQ),同時氧化型細(xì)胞色素C轉(zhuǎn)化為還原型細(xì)胞色素C,在分光光度儀下產(chǎn)生吸光峰值的變化550nm 波長),由此定量測定輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)是:

產(chǎn)品內(nèi)容

 緩沖液(Reagent A         毫升

 反應(yīng)液(Reagent B            微升

 陰性液(Reagent C         毫升

 底物液(Reagent D         微升

 專性液(Reagent E         微升

 穩(wěn)定液AReagent F1        

 穩(wěn)定液BReagent F2         毫升

產(chǎn)品說明書             1

保存方式

保存在-20冰箱里,避免反復(fù)凍融  反應(yīng)液(Reagent B)和  底物液(Reagent D),避免光照,有效保證3

用戶自備

比色皿:用于比色的容器

分光光度儀:用于比色分析

培養(yǎng)箱:用于孵育反應(yīng)物

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化;  反應(yīng)液(Reagent B  底物液(Reagent D注意避光

一、 測定準(zhǔn)備

1. 準(zhǔn)備好待測樣品(例如細(xì)菌膜蛋白樣品等),置于冰槽里

2. 設(shè)定好分光光度儀(溫度為30℃):波長為550nm,間隔60秒,讀數(shù)3次(共2分鐘),并置零

3.  緩沖液(Reagent A室溫下均衡溫度

4. 實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的  穩(wěn)定液BReagent F2置入冰槽里融化,然后移出xx毫升到  穩(wěn)定液AReagent F1管里,混勻后,標(biāo)記為  穩(wěn)定工作液置于冰槽里備用(注意,15分鐘內(nèi)使用,用完后丟棄)然后將-20℃冰箱里的試劑盒中的  反應(yīng)液(Reagent B室溫下融化,然后移出10微升到新的1.5毫升離心管,加入xx微升  穩(wěn)定工作,輕柔混勻后,室溫下避光靜置15分鐘(可見顏色變白),標(biāo)記為  反應(yīng)工作液。然后即刻進(jìn)行下列操作

二、 背景對照測定

1. 移取xx微升  緩沖液(Reagent A到新的比色皿

2. 加入10微升  反應(yīng)工作

3. 加入xx微升  底物液(Reagent D

4. 室溫下靜置10分鐘,避免光照

5. 加入xx微升  陰性液(Reagent C

6. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))

7. 即刻放入分光光度儀檢測,此為背景空對照:550波長讀數(shù)1分鐘或2分鐘550波長讀數(shù)0分鐘

三、 樣品總活性測定

1. 移取xx微升  緩沖液(Reagent A到新的比色皿

2. 加入10微升  反應(yīng)工作

3. 加入xx微升  底物液(Reagent D

4. 室溫下靜置10分鐘,避免光照

5. 加入100微升待測樣品(注意:15微克細(xì)菌膜蛋白

6. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))

7. 即刻放入分光光度儀檢測,此為樣品總活性讀數(shù):550波長讀數(shù)1分鐘或2分鐘550波長讀數(shù)0分鐘

四、 樣品非特異活性測定

1. 移取xx微升  緩沖液(Reagent A到新的比色皿

2. 加入10微升  反應(yīng)工作,避免光照

3. 加入xx微升  底物液(Reagent D

4. 室溫下靜置10分鐘,避免光照

5. 加入xx微升  專性液(Reagent E

6. 加入100微升待測樣品(注意:15微克細(xì)菌膜蛋白

7. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))

8. 即刻放入分光光度儀檢測,此為樣品特異活性讀數(shù):550波長讀數(shù)1分鐘或2分鐘550波長讀數(shù)0分鐘

五、 計算樣品活性

1)樣品活性(總活性和非特異活性)

2)樣品特異活性

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品為21次操作(10個樣本),包括1次背景對照測定

2. 操作時,須戴手套

3. 系統(tǒng)操作過程中,背景測定只需1

4. 如果增強(qiáng)酶活檢測,建議使用細(xì)菌膜蛋白樣品。推薦使用  細(xì)菌呼吸鏈復(fù)合物檢測樣品制備試劑盒GMS15142

5. 每增加1個樣品,增加  反應(yīng)工作液為:  反應(yīng)液(Reagent B5微升+  穩(wěn)定工作5微升,以此類推。配制反應(yīng)工作液時,須根據(jù)樣本數(shù)量配制實(shí)際工作液容量

6. 用戶可以根據(jù)實(shí)際樣品,計算  緩沖液(Reagent A  反應(yīng)工作  底物液(Reagent D三者之和,混勻后,室溫下靜置10分鐘后,即刻檢測

7. 加入樣品啟動反應(yīng)3秒內(nèi)即刻比色測定

8. 分光光度計波長嚴(yán)格設(shè)置在550nm,誤差10nm將不產(chǎn)生信號

9. 測定可以持續(xù)2分鐘

10. 測定值由低到高變化,即2分鐘測定讀數(shù)高于0分鐘測定讀數(shù),表明有酶活性

11. 比色測定后,比色皿須清洗

12. 建議用戶使用分光光度儀檢測,總體系減半可以增加檢測樣本數(shù)

13. 建議待測樣本蛋白濃度為15微克/100微升;如果樣本酶活性過低或過高,則可以增加或降低樣本量;注意計算公式的調(diào)整(本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1

14. 如果使用細(xì)裂解液,則蛋白濃度為50微克/100微升

15. 樣品特異活性是指抗霉素敏感的輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶,去除其它干擾因素(例如復(fù)合物I/II/IV等)

16. 細(xì)菌呼吸鏈復(fù)合物III(輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶)單位活性定義為:在30℃,pH 7.5條件下,每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型泛醌CoQH2所需的酶量作為一個活性單位

17. 本公司提供系列細(xì)菌酶類技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確



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