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 細(xì)菌呼吸鏈復(fù)合物3（bc-1 complex）活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

 細(xì)菌呼吸鏈復(fù)合物3（bc-1 complex）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在使用還原性合成輔酶Q同功類似物和特異性抑制劑，通過反應(yīng)系統(tǒng)測定樣品中細(xì)胞色素C還原后峰值的增高，即采用比色法測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種野生、培養(yǎng)或病原性細(xì)菌膜蛋白懸液樣品的輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶的特異性活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

細(xì)菌呼吸鏈復(fù)合物III，通常稱為輔酶Q－細(xì)胞色素C還原酶、細(xì)胞色素還原酶或bc1復(fù)合物（ubiquinol cytochrome c oxidoreductase；cytochrome reductase；bc1 complex），是細(xì)菌電子傳遞鏈的中心元素，位于革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌（除大腸桿菌和古生菌等），包括光合成細(xì)菌的細(xì)胞膜上，為寡聚體膜蛋白復(fù)合物。細(xì)菌使用氧氣、氮、硫化物等作為終端電子受體。細(xì)菌復(fù)合物III含有三個亞單位，包括細(xì)胞色素b（Cytochrome b），細(xì)胞色素c1（cytochrome c1）和Rieske鐵硫蛋白（Rieske iron-sulfur protein），通過Q循環(huán)（Q cycle）進(jìn)行催化作用。其特征性的酶活性是抗霉素敏感的輔酶Q－細(xì)胞色素C還原酶。復(fù)合物III催化氧化型細(xì)胞色素C被還原為還原型細(xì)胞色素C，細(xì)菌內(nèi)電子由低電位的供體還原型泛醌（ubiquinol；UQH2）或還原型輔酶Q（reduced Coenzyme Q；CoQH₂）傳遞到細(xì)胞色素C或質(zhì)體藍(lán)素（plastocyanin）上的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，進(jìn)行呼吸鏈傳遞。細(xì)菌復(fù)合物3和復(fù)合物4的相互作用，形成泛醌氧化酶（quinol oxidase）。輔酶Q－細(xì)胞色素C還原酶反應(yīng)系統(tǒng)測定氧化型細(xì)胞色素C的濃度變化。基于還原型泛醌或還原型輔酶Q底物，在抗霉素存在與否的情況下，通過輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶的催化，轉(zhuǎn)化成泛醌（ubiquinone；UQ）或輔酶Q（Coenzyme Q；CoQ），同時氧化型細(xì)胞色素C，轉(zhuǎn)化為還原型細(xì)胞色素C，在分光光度儀下產(chǎn)生吸光峰值的變化（550nm 波長），由此定量測定輔酶Q－細(xì)胞色素C還原酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)是：

產(chǎn)品內(nèi)容

 緩沖液（Reagent A）         毫升

 反應(yīng)液（Reagent B）            微升

 陰性液（Reagent C）         毫升

 底物液（Reagent D）         微升

 專性液（Reagent E）         微升

 穩(wěn)定液A（Reagent F1）         管

 穩(wěn)定液B（Reagent F2）         毫升

產(chǎn)品說明書             1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；  反應(yīng)液（Reagent B）和  底物液（Reagent D），避免光照，有效保證3月

用戶自備

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；  反應(yīng)液（Reagent B）和  底物液（Reagent D）注意避光。

一、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)菌膜蛋白樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為550nm，間隔60秒，讀數(shù)3次（共2分鐘），并置零

3．  緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

4． 實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  穩(wěn)定液B（Reagent F2）置入冰槽里融化，然后移出xx毫升到  穩(wěn)定液A（Reagent F1）管里，混勻后，標(biāo)記為  穩(wěn)定工作液，置于冰槽里備用（注意，15分鐘內(nèi)使用，用完后丟棄）。然后將－20℃冰箱里的試劑盒中的  反應(yīng)液（Reagent B）室溫下融化，然后移出10微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升  穩(wěn)定工作液，輕柔混勻后，室溫下避光靜置15分鐘（可見顏色變白），標(biāo)記為  反應(yīng)工作液。然后即刻進(jìn)行下列操作。

二、 背景對照測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入10微升  反應(yīng)工作液

3． 加入xx微升  底物液（Reagent D）

4． 室溫下靜置10分鐘，避免光照

5． 加入xx微升  陰性液（Reagent C）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照：550波長讀數(shù)1分鐘或2分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘

三、 樣品總活性測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入10微升  反應(yīng)工作液

3． 加入xx微升  底物液（Reagent D）

4． 室溫下靜置10分鐘，避免光照

5． 加入100微升待測樣品（注意：15微克細(xì)菌膜蛋白）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：550波長讀數(shù)1分鐘或2分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘

四、 樣品非特異活性測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入10微升  反應(yīng)工作液，避免光照

3． 加入xx微升  底物液（Reagent D）

4． 室溫下靜置10分鐘，避免光照

5． 加入xx微升  專性液（Reagent E）

6． 加入100微升待測樣品（注意：15微克細(xì)菌膜蛋白）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：550波長讀數(shù)1分鐘或2分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘

五、 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

2）樣品特異活性

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為21次操作（10個樣本），包括1次背景對照測定

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 如果增強(qiáng)酶活檢測，建議使用細(xì)菌膜蛋白樣品。推薦使用  細(xì)菌呼吸鏈復(fù)合物檢測樣品制備試劑盒－GMS15142

5． 每增加1個樣品，增加  反應(yīng)工作液為：  反應(yīng)液（Reagent B）5微升＋  穩(wěn)定工作液5微升，以此類推。配制反應(yīng)工作液時，須根據(jù)樣本數(shù)量配制實(shí)際工作液容量

6． 用戶可以根據(jù)實(shí)際樣品，計算  緩沖液（Reagent A）、  反應(yīng)工作液和  底物液（Reagent D）三者之和，混勻后，室溫下靜置10分鐘后，即刻檢測

7． 加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測定

8． 分光光度計波長嚴(yán)格設(shè)置在550nm，誤差10nm將不產(chǎn)生信號

9． 測定可以持續(xù)2分鐘

10． 測定值由低到高變化，即2分鐘測定讀數(shù)高于0分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性

11． 比色測定后，比色皿須清洗

12． 建議用戶使用分光光度儀檢測，總體系減半可以增加檢測樣本數(shù)

13． 建議待測樣本膜蛋白濃度為15微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整（本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

14． 如果使用細(xì)菌裂解懸液，則蛋白濃度為50微克/100微升

15． 樣品特異活性是指抗霉素敏感的輔酶Q－細(xì)胞色素C還原酶，去除其它干擾因素（例如復(fù)合物I/II/IV等）

16． 細(xì)菌呼吸鏈復(fù)合物III（輔酶Q－細(xì)胞色素C還原酶）單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型泛醌（CoQH₂）所需的酶量作為一個活性單位

17． 本公司提供系列細(xì)菌酶類技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確