艾美捷雙鏈RNA定量試劑盒基本參數(shù)：

品名：雙鏈RNA（dsRNA），ELISA試劑盒

同義詞名稱：dsRNA ELISA試劑盒

僅供研究使用。不適用于診斷程序。

克隆性：單克隆

同位素：小鼠IgG2a-kappa/IgM-kappa

克隆編號(hào)：J2/K2

物種反應(yīng)性：全體的

艾美捷雙鏈RNA定量試劑盒來(lái)源：

本試劑盒中使用的兩種dsRNA抗體如下：雌性DBA/2小鼠腹腔注射50ug L-dsRNA和75ug甲基化牛血清白蛋白的混合物，在完-全弗氏佐劑中乳化。在幾次增強(qiáng)后，將脾細(xì)胞與Sp2/0-Agl4骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤克隆J2和K2。

該試劑盒包含以下試劑，用于200次測(cè)試（2x96孔）：

試劑01：1小瓶包衣抗體（儲(chǔ)存于-20℃

試劑A：1小瓶142 bp dsRNA作為陽(yáng)性對(duì)照（儲(chǔ)存于-20℃）

試劑B：1小瓶dsRNA特異性檢測(cè)抗體（在RPMI+5%FBS中，儲(chǔ)存在+4℃或最好是-20℃）

試劑C：1小瓶HRP綴合的F（ab’）2山羊抗小鼠二級(jí)抗體片段（儲(chǔ)存于+4℃或-20℃）

試劑D：1小瓶TMB底物溶液（儲(chǔ)存于+4℃，避光

艾美捷雙鏈RNA定量試劑盒試驗(yàn)方案：

所需但未提供的材料和設(shè)備

2個(gè)ELISA板（96孔）

具有370 nm和450 nm雙波長(zhǎng)能力的微量板讀數(shù)分光光度計(jì)。

單通道移液管-10ul和200ul

多通道移液管-200ul

抗原（標(biāo)準(zhǔn)和樣品）稀釋劑（STE緩沖液：0.1M NaCl、1mM EDTA、50mM Tris-HCl，pH7.0）

洗滌緩沖液（PBS+0.5%吐溫20；PBS:10mM Pi緩沖液，pH7.2，0.15M NaCl）

二級(jí)抗體稀釋緩沖液（PBS+1%BSA）

培養(yǎng)箱，允許在37℃下培養(yǎng)。

2米硫酸氫

試劑和ELISA板的制備

通過加入4ul不含RNase的MilliQ水，重新配制試劑A。濃度為1ug/ul dsRNA。（儲(chǔ)存于-20攝氏度或-80攝氏度）

使用DEPC處理過的MilliQ水制備STE（適用于您自己的樣品制備）

通過高壓滅菌滅菌PBS和STE

制備PBS+1%BSA和ELISA洗滌緩沖液

ELISA板涂層

將試劑01管的總含量轉(zhuǎn)移到21 ml PBS中，充分混合并立即在2個(gè)ELISA板中分配100ul/孔。

蓋上盤子，在4攝氏度下孵育過夜。

將井中的內(nèi)容物丟棄到廢物中。向每個(gè)孔中加入100ul/孔1%BSA在PBS+0.2%NaN3中的溶液，并在37℃下孵育2小時(shí)，以飽和板上任何剩余的自由結(jié)合位點(diǎn)。

丟棄溶液并用PBS+0.5%吐溫20洗滌板3次。

然后可以直接使用或儲(chǔ)存這些板。為了儲(chǔ)存，用含0.2%疊-氮化鈉的200ul/孔PBS填充孔。將盤子用塑料箔包裹起來(lái)，在4攝氏度下冷藏保存。它們可以在一個(gè)月內(nèi)保持活力。使用儲(chǔ)存板時(shí)，必須用PBS徹-底清洗，以去除所有痕量的NaN3。

1個(gè)板的分析方案：

所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品應(yīng)至少檢測(cè)兩份。

使用干凈、無(wú)RNase的帶蓋微型離心管。

不要使用含有NaN3的緩沖液，因?yàn)樗鼤?huì)干擾最終檢測(cè)步驟。

1.從試劑A制備1:3系列稀釋液。dsRNA標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋系列應(yīng)在樣品的預(yù)期dsRNA濃度范圍內(nèi)。我們建議以30ng dsRNA/孔作為最高濃度，并稀釋至低于0.01ng dsRNA/孔。每次化驗(yàn)應(yīng)新鮮稀釋。

2.在STE中制備樣品稀釋液（必要時(shí)）。

3.蓋上并旋渦所有稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。

4.從ELISA板上取下塑料箔，丟棄液體并用PBS+0.5%吐溫20洗滌兩次。

5.丟棄溶液并將100-100ul抗原轉(zhuǎn)移到板中的重復(fù)孔中。

6.蓋上蓋子并在37℃下孵育60分鐘。

7.將井中的內(nèi)容物丟棄到廢物中。用PBS+0.5%吐溫20洗滌板4次，每孔加入250ul洗滌液。在加入下一種溶液之前，不要讓井變干。

8.用移液管將100ul未稀釋試劑B移到所有孔中。

9.蓋上蓋子，在37℃下孵育60分鐘。

10.在孵育（步驟9）期間，通過將1.4ul試劑C移液至10ml PBS+1%BSA

艾美捷雙鏈RNA定量試劑盒原理：

基于使用兩種雙鏈 RNA (dsRNA) 特異性單克隆抗體，dsRNA 檢測(cè)試劑盒可以靈敏和選擇性地檢測(cè) dsRNA 分子（大于 30-40 bp），而不受其核苷酸組成和序列的影響。檢測(cè)具有高度特異性：在存在 1.000-10.000 倍過量其他核酸的情況下，可以檢測(cè)核酸提取物中的dsRNA。該測(cè)定基于雙抗夾心ELISA原理，使用 J2 (IgG2a) 小鼠單克隆抗體作為捕獲抗體，單克隆抗體 K2 (IgM) 用作檢測(cè)抗體。