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詳述ELISA常見(jiàn)四個(gè)問(wèn)題與解決方法

來(lái)源:上海撫生實(shí)業(yè)有限公司   2022年11月07日 13:36  

ELISA 即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定,是一類常用的免疫酶技術(shù)。主要方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,然后利用酶標(biāo)記(偶聯(lián))的抗體或抗原與之孵育,加入顯色劑顯色,通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定待測(cè)物顏色與標(biāo)準(zhǔn)物顏色的差異,繪制出酶活曲線得出待測(cè)物濃度。下面詳述ELISA常見(jiàn)四個(gè)問(wèn)題與解決方法:

1. 陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果

①  樣品、試劑被污染,或加樣時(shí)操作不當(dāng)導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑,小心操作。

② 酶標(biāo)板洗滌不徹di——洗板前先將抗體溶液倒干凈,然后清洗液倒?jié)M板孔,確保能充分洗滌。

③ 抗體量過(guò)多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說(shuō)明書(shū)的推薦量使用抗體,稀釋抗體到適當(dāng)濃度。

2.酶標(biāo)板整體背景高

① 抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進(jìn)行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。

② 底物結(jié)合濃度過(guò)高——對(duì)底物進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

③ 反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)——當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)時(shí)立即使用終止液終止反應(yīng),適當(dāng)縮短顯色時(shí)間。

④ 底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的,若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染,應(yīng)更換新的底物溶液。

⑤ 底物孵育過(guò)程沒(méi)有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。

3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差

① 樣品數(shù)量不整齊,加樣時(shí)間有長(zhǎng)有短——加重復(fù)孔時(shí)盡量保持加樣時(shí)間與第一次接近。

② 加樣量不一致——樣品稀釋前應(yīng)充分混勻,并且使用同一移液槍。

③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測(cè)定樣品時(shí),操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。

4. 吸光值偏高或偏低

① 樣品中待測(cè)抗原含量太低會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低——可嘗試增加樣品使用量。

② 加入抗體量不合適會(huì)造成結(jié)果偏低或偏高——使用建議抗體量或?yàn)榱耸菇Y(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的zui適用量。

③ 孵育時(shí)間太短導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低——適當(dāng)延長(zhǎng)抗體或抗原的孵育時(shí)間,確保待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體能充分結(jié)合。

④ 孵育溫度不適合——應(yīng)保證抗體在最適宜條件下進(jìn)行孵育(一般37℃孵育1h)。


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