背景介紹

2022年8月1日，由國家藥品監督管理局發布YY/T 1805.3-2022《組織工程醫療器械產品 膠原蛋白 第3部分：基于特征多肽測定的膠原蛋白含量檢測 液相色譜-質譜法》醫療器械行業標準正式實施。該標準適用于組織提取純化的膠原蛋白及其膠原類產品中不同類型膠原蛋白特征多肽含量的測定，并規定了液相色譜-質譜法測定不同類型膠原蛋白特征多肽含量的方法。該標準由全國外科植入物和矯形器械標準化技術委員會組織工程醫療器械產品分技術委員會（SAC/TC110/SC3）歸口，島津中國創新中心使用LCMS-8050參與了新標準的研制和驗證工作，助您一起輕松應對新標準的應用。

膠原蛋白檢測新標準來襲，您準備好了么？

標準解讀

膠原蛋白具有良好的生物降解性、生物相容性和弱抗原性，成為應用最為廣泛的生物材料之一。膠原蛋白產品屬于大分子，可用液相色譜法、MALDI質譜法，凝膠電泳法對其整體性能進行表征。但不同動物來源及不同類型的膠原蛋白的結構、分子量、等電點等理化性質較為相似，上述傳統方法對膠原內部精細結構的變化識別能力有限，無法實現膠原類別的精準鑒別。本標準基于液相色譜質譜特征多肽法可實現不同動物來源不同類型的膠原蛋白的定性和定量檢測，為膠原蛋白產品的定性及純度判別提供了依據。膠原蛋白是大分子纖維狀蛋白，具有三螺旋結構，本標準采用熱變性處理使其三螺旋結構解旋并溶解，胰蛋白酶酶解后對不同類型膠原的特征肽進行檢測。為了減少質譜分析時基質的干擾并提高方法的準確性，本標準采用內標法進行定量。

本標準的頒布對不同類型膠原產品進行精準鑒別、規范動物源膠原的監管、提高膠原產品的理化表征能力和生物安全性等方面具有深遠的意義。

圖1.《組織工程醫療器械產品 膠原蛋白

第3部分：基于特征多肽測定的膠原蛋白

含量檢測 液相色譜-質譜法》醫藥行業標準發布稿

特征多肽法的原理：篩選已知序列目標蛋白中*且穩定存在的肽段，利用液質聯用技術檢測該肽段含量從而推算目標蛋白的含量。該方法通常使用胰蛋白酶特異性地酶解精氨酸和賴氨酸的C末端，生成具有堿性氨基酸末端的多肽，因此具有較強的方法專屬性和檢測靈敏度。目前特征多肽法已成功應用于膠類中藥的真偽鑒別，食品中過敏原的檢測以及乳品中A2 β-酪蛋白的含量測定等工作中。

島津解決方案

島津三重四極桿液相色譜質譜聯用儀LCMS-8050采用全新設計的加熱ESI源和新型碰撞池UFsweeperⅢ，大幅提高了靈敏度。在確保數據準確度和精度的同時，LCMS-8050可實現555 ch/sec的高速MRM采集和5 msec的正負極性切換。即便對于未*分離的色譜峰，LCMS-8050也可實現定量離子、參比離子和內標離子充分的采集。

Skyline軟件是由西雅圖華盛頓大學的MacCoss團隊開發的一款蛋白質靶向分析的專業軟件，實現了從蛋白質到多肽再到MRM離子對檢測列表的轉化。其獨特的保留時間預測功能以及碰撞能量預測功能使得多肽分析方法的開發變得更加便捷。島津LabSolutions工作站與Skyline軟件無縫銜接，是靶向蛋白質定量方法開發的得力工具。

分析儀器

表1. 豬I型膠原蛋白特征多肽MRM檢測參數

*定量離子對

豬I型膠原蛋白特征多肽對照品的典型色譜圖見圖2，二級質譜圖見圖3。

圖2. 豬I型膠原蛋白特征多肽

對照品典型色譜圖

圖3. 豬I型膠原蛋白特征多肽

對照品典型二級質譜圖

結 論

膠原基生物材料中膠原蛋白的含量檢測是膠原蛋白制品品質評價，工藝穩定性評價的重要要素。豬I型膠原海綿是一種重要的醫用膠原制品，其主要成分豬I型膠原蛋白分子量逾40萬，液質聯用儀無法直接檢測。本方法采用碳酸氫銨水溶液稀釋并使用胰蛋白酶酶解。通過檢測豬I型膠原特征肽的含量，折算出膠原海綿中豬I型膠原蛋白的含量。本法具有前處理操作簡便，方法特異性好，精密度高等優點，方法穩定可靠，可在膠原醫療器械產品檢測領域推廣。

-參考文獻 -

《YYT 1805.3-2022 組織工程醫療器械產品

膠原蛋白第3部分：基于特征多肽測定的膠原蛋白

含量檢測——液相色譜-質譜法》