聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 是分子生物學(xué)中廣泛使用的一種方法，用于制作特定DNA片段的多個拷貝。PCR能夠使特定目標(biāo)/測試樣本的少量（低至單個拷貝）DNA以指數(shù)方式擴增，以生成數(shù)千到數(shù)百萬個拷貝的特定DNA片段。如果目標(biāo)樣品是RNA，也可以添加前體逆轉(zhuǎn)錄過程 (RT-PCR)。RT過程首先將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，然后通過PCR過程對DNA進行擴增。

以下是經(jīng)典PCR方法中涉及的典型試劑和組分以及它們各自所起的作用：

1、核苷酸（例如：三磷酸核苷，dNTP）——是用于制造新DNA的分子構(gòu)件，即“原材料”；

2、酶

I. (Taq) DNA聚合酶——驅(qū)動DNA復(fù)制過程所需的酶；

II.逆轉(zhuǎn)錄酶——將目標(biāo)RNA轉(zhuǎn)化為DNA所需的酶；

3、引物——合成DNA寡核苷酸所需的短的單鏈DNA/RNA片段，有專門設(shè)計以適配目標(biāo) DNA區(qū)域的側(cè)翼。它們?yōu)?/span>DNA合成提供了起點。一般需要兩個引物，分別用于目標(biāo)區(qū)域的兩側(cè)；

4、檢測探針或染料

I. 探針——熒光標(biāo)記的寡核苷酸

結(jié)合每個引物的下游區(qū)域。一般需要兩種不同的探針，當(dāng)它們都連接到特定的DNA片段時則會發(fā)出熒光，以在擴增過程中提供可檢測的指示信號；

II. 染料——在DNA存在時會發(fā)出熒光，以在擴增進行時提供可檢測的指示信號；

5、其他賦形劑，如MgCl2輔因子、pH緩沖液、甘露醇、海藻糖、BSA、PEG2000等；

6、目標(biāo)DNA/RNA

I. 對于診斷試劑盒，指的是試劑盒正在檢測并準(zhǔn)備復(fù)制的目標(biāo)DNA（來自病毒、細菌等）；或者從被測樣品中進行提取（如果可行的話）；

II. 用于研究/實驗室工作——要復(fù)制的特定DNA。

PCR方法存在的處理挑戰(zhàn)

PCR 方法存在許多處理挑戰(zhàn)。各個組分需要在96孔板或“雞尾酒”離心管中進行準(zhǔn)確組合。這些組分都需要冷藏，并且保質(zhì)期也相對較短，同時交叉污染會是一個大問題。更糟糕的是，工作臺移液錯誤也會造成麻煩。

標(biāo)準(zhǔn)PCR過程需要特定的熱循環(huán)重復(fù)加熱/冷卻反應(yīng)試管30-40個循環(huán)，以實現(xiàn)DNA的擴增過程。擴增儀也應(yīng)該有一個熒光計來監(jiān)測擴增的目標(biāo)DNA。

另外還有一些更新的擴增方法，例如環(huán)介導(dǎo) (LAMP) 和重組酶聚合酶擴增 (RPA) ，這些方法是等溫過程，不需要熱循環(huán)和使用特殊設(shè)備。

                          圖1：PCR擴增熱循環(huán)儀

最新的技術(shù)則是將試劑加載到微流體通道/芯片上。以更少量的試劑和更低熱量有望實現(xiàn)更快和更精確的溫度循環(huán)，從而產(chǎn)生更快的結(jié)果。

                                           圖2：微流控PCR芯片

PCR&冷凍干燥

冷凍干燥已成為PCR過程的一個重要流程，主要用于單個試劑和最終產(chǎn)品檢測試劑盒的生產(chǎn)。研究表明，PCR 擴增效率通常不會由于單個試劑或PCR診斷試劑盒使用了凍干而受影響。雖然凍干可能會使探針的熒光強度略有下降，但并不影響整個測量過程。

凍干PCR產(chǎn)品追求1-3%的最終水分含量。建議通過 Karl-Fisher 滴定法測量水分。

凍干PCR 試劑和診斷試劑盒具有很強的吸濕性。從凍干機中取出產(chǎn)品時，必須小心避免暴露在環(huán)境濕氣中。濕度受控的房間或隔離設(shè)備可用于減緩水分的再吸收。對于產(chǎn)品的儲存和運輸，試劑必須密封在防潮容器中，例如鋁袋。

冷凍的聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶可能含有高達50%的甘油作為冷凍保護劑和穩(wěn)定劑。甘油不利于凍干，因為它會干擾水分的去除，從而影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)。因此凍干時要注意優(yōu)先選擇不含甘油的試劑。

凍干PCR

用于PCR試劑的凍干設(shè)備須知

由于測量的試劑樣品量以微升為單位，一批次凍干PCR試劑中的總水分含量非常小。冷凍干燥機設(shè)計不需要具有1:1的擱板表面與冰冷凝器表面積比，因為這主要用于高水分、散裝液體或西林瓶應(yīng)用。

當(dāng)產(chǎn)品樣本大小在微升范圍內(nèi)時，是很難使用產(chǎn)品探針的。因此在工藝開發(fā)時，皮拉尼/電容壓力計壓力差比較法是更為推薦的干燥終點工具。如果凍干機配備隔離閥且能夠?qū)崿F(xiàn)自動開啟和關(guān)閉，也可以使用壓力升法進行測試。

另外，凍干機中的制冷系統(tǒng)也應(yīng)考慮精準(zhǔn)優(yōu)化（與常識保留冗余的設(shè)計理念相反），較小的壓縮機可以大大減少室內(nèi)熱量的消耗。這意味著對于電壓和能源占用較小。風(fēng)冷的中試型凍干機型號更適用于中等批量的診斷試劑的生產(chǎn)和研發(fā)，這避免了對冷卻水設(shè)施的需求，因為冷卻水設(shè)施對于大部分PCR試劑盒生產(chǎn)場地而言中可能并不容易獲取。

SP Scientific VirTis Ultra系列凍干機非常適合診斷應(yīng)用。它以緊湊的配置提供超過2平方米的擱板面積。這使得客戶在樣品處理中具有很大的靈活性。

         圖3：SP VirTis Ultra 中試和小型生產(chǎn)凍干機

PCR診斷檢測試劑盒的凍干工藝須知

凍干PCR診斷試劑盒的明顯優(yōu)勢是消除了試劑盒冷藏運輸和儲存的冷鏈依賴，延長了其可用保質(zhì)期。

96孔板是用于PCR診斷試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)配置。相比較手動進樣這種繁瑣的操作，使用自動化液體灌裝設(shè)備，除了更快的裝載時間和更高的吞吐量外，它還提供更好的過程控制和可重復(fù)性。

在批量裝載到凍干機的過程中，控制產(chǎn)品的蒸發(fā)和產(chǎn)品溫度會是一個問題，特別是對于具有較大批量的較大裝置，*裝載需要比較長的時間。對擱板進行預(yù)冷上會降低上述問題帶來的影響。如果加載到芯片或微流體通道上，那么蒸發(fā)和傳熱又會是一個大問題。

凍干過程取決于足夠的熱量傳遞到產(chǎn)品中。大多數(shù)96孔是塑料管，底部與冷凍干燥機擱板接觸的表面積很小。在冷凍干燥過程中可以使用鋁制冷卻塊來增加傳導(dǎo)熱傳遞。

                             圖4：用于 96 孔的鋁質(zhì)傳熱模具

對流傳熱在凍干中也很重要，因為它可以幫助產(chǎn)品在貨架上更均勻地分配熱量，減輕由輻射傳熱差異引起的邊緣效應(yīng)。在產(chǎn)品支持的前提下，使用更低的真空度（例如：100mTorr 而不是 60mTorr）將提供更均勻的對流傳熱。然而，許多PCR試劑的塌陷溫度非常低，因此凍干過程中設(shè)置較高的壓力可能并不總是可行的。可以在配方中添加賦形劑，提高塌陷溫度，以允許更高的壓力設(shè)置。這樣做的其他好處包括使配方更容易轉(zhuǎn)移到其他可能無法實現(xiàn)非常低真空設(shè)置的凍干機（減少工藝放大的風(fēng)險），以及減少阻塞流現(xiàn)象發(fā)生的概率。

出于信號校準(zhǔn)的目的，診斷試劑盒通常包含不含目標(biāo)DNA/RNA的陰性對照混合物和含有目標(biāo)DNA/RNA的陽性對照混合物。除了包含測試樣品的混合物之外，還分析對照樣品，并比較熒光信號以確定患者樣品是陽性還是陰性。處理陽性對照樣品的一個問題是凍干機內(nèi)部存在交叉污染的高風(fēng)險。因此建議客戶分別使用多個凍干機，陽性對照始終在同一設(shè)備中進行處理。

單個PCR試劑源材料的冷凍干燥

除了延長保質(zhì)期和避免對供應(yīng)冷鏈的需求外，實驗室使用凍干PCR試劑的其他好處包括：

●   更穩(wěn)健的工藝，更高的可靠性和更少的批次變化，因為冷凍干燥大大降低了實驗室工作臺移液錯誤和污染的可能性；

●   避免多次凍融循環(huán)的破壞性影響；

●   減少設(shè)置和處理時間；

●   減少過期產(chǎn)品的浪費，降低運輸和儲存成本。

為方便起見，預(yù)配制的凍干PCR“Master-Mix”試劑目前也可在市面上進行購買，它可以通過消除實驗室工作臺上的一些混合步驟來提高通量。主混合物通常包含核苷酸、酶、輔因子和緩沖液。

凍干微珠

一些 PCR 試劑供應(yīng)商在實驗室實驗中采用的一種常見方法是提供冷凍干燥的試劑預(yù)混珠，在凍干之前使用專門的設(shè)備用液氮冷凍。

                          圖5：凍干 PCR 微珠

在凍干之前使用液氮預(yù)凍試劑存在權(quán)衡取舍。極快的冷凍速度可最大限度地減少冷凍濃度效應(yīng)，例如pH變化。然而，它也會帶來非常小的冰晶尺寸，這會導(dǎo)致在干燥過程中對蒸汽流動的阻力更大并且干燥時間更慢。PCR的小樣本量可以降低這方面的影響，但需要凍干機提供更冷的擱板溫度和更低的真空度來防止珠子在初級干燥過程中熔化。

此外，珠子必須保持冷凍。可以使用冷藏的冷盤來輔助。冷凍干燥機擱板也需要預(yù)冷，以避免產(chǎn)品在抽真空之前熔化。要注意的是在產(chǎn)品室門在真空下密封之前，預(yù)冷凍擱板會導(dǎo)致環(huán)境條件下結(jié)霜。

冷凍干燥的顆粒或珠子通常放置在PCR管中，然后密封在防潮袋中。

綜上所述，PCR診斷試劑的凍干需要考慮多種因素，其中包括商用原料的類型和凍干機的選用。萊奧德創(chuàng)可以為客戶提供一站式診斷試劑凍干工藝解決方案，從配方的設(shè)計到商業(yè)化生產(chǎn)階段均可為客戶提供快速、可靠的委托服務(wù)。

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