磷酸化蛋白富集試劑盒使用方法:

準備：第一次使用本試劑盒時需要將所有 DNase I 干粉倒入溶液 B 中，輕柔顛倒 使 DNase 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，最好在一個月內完，否則 DNase 將逐漸失去活性。此外，最好在實驗前 1 小時將溶液 B 冰浴預冷。 

用法一：小量制備（主要用于上樣量比較小的 SDS-PAGE 電泳等實驗）

1、 收集 20-40 mL 過夜培養的細菌飽和培養液（OD420 在 1.5 左右即可），2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

2、 加入 2 mL 溶液 A，輕柔吹打，將細菌重懸于溶液 A 中。

3、 2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。 4、 加入 0.5 mL 溶液 B（必須已經提前加入了 DNase I 干粉），輕柔吹打使細菌 重懸。注：如果細菌起始量沒有 20-40 mL，溶液 A 的用量可以等比例降低。 重懸在溶液 A 中的細菌可以放-80℃長期保存。 

5、 用超聲或 French Press 方法裂解細胞。如果用 French Press 方法，則需要 處理至少兩次，每次的壓力為 9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不論用哪 種裂解方法，都必須在顯微鏡下檢查細菌是否已經裂解，否則還需要重復細菌 裂解過程，直到 80%以上的細菌都裂解為止。

6、 2500g 室溫離心 8 分鐘后小心轉移上清到新的 10 mL-15 mL 塑料離心管中 （如 Beckman Optima 臺式超速離心機離心管），棄沉淀（未破裂細胞）。

7、 在上清（細菌裂解液）中加入 5 mL 預冷的溶液 C，輕柔顛倒混勻后冰浴放置 30-60 分鐘。其間可以輕柔顛倒混勻 3-5 次。

8、 用 Bechman Optima 臺式超速離心機 115，000g 4℃離心 60 分鐘。也可以 使用其他冷凍超速離心機，但離心力應該一致，否則有可能得不到沉淀。

9、 小心移棄上清，在沉淀中加入 0.2 mL 溶液 A，充分吹打混勻。

10、用 Beckman Optima 臺式超速離心機 115，000g 4℃離心 60 分鐘。也可 以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應該一致，否則有可能得不到沉淀。 11、小心移棄上清，所得沉淀放-20℃長期保存，也可以直接加入 0.1 mL 自備的， 跟后續實驗兼容的緩沖液（如 1×SDS-PAGE 上樣液中，可從本公司購買）， 所得膜蛋白的濃度將在 1mg/mL 左右。

用法二：大量制備（主要用于上樣量比較大的 2D 電泳等實驗） 

1、 收集 200-400 mL 過夜培養的細菌飽和培養液（OD420 在 1.5 左右即可），2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

2、 加入 20 mL 溶液 A，輕柔吹打，將細菌重懸于溶液 A 中。

3、 2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

4、 加入 5 mL 溶液 B（必須已經提前加入了 DNase I 干粉），輕柔吹打使細菌重懸。注：如果細菌起始量沒有 200-400 mL，溶液 A 的用量可以等比例降低。重懸在溶液 A 中的細菌可以放-80℃長期保存。

5、 用超聲或 French Press 方法裂解細胞。如果用 French Press 方法，則需要處理至少兩次，每次的壓力為 9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不論用哪種裂解方法，都必須在顯微鏡下檢查細菌是否已經裂解，否則還需要重復細菌裂解過程，直到 80%以上的細菌都裂解為止。

6、 2500g 室溫離心 8 分鐘后小心轉移上清到干凈的玻璃燒杯中，棄沉淀（未破裂細胞）。

7、 在上清（細菌裂解液）中加入 50 mL 預冷的溶液 C，輕輕在冰浴中攪拌混勻30-60 分鐘。注：可以在大燒杯中裝冰，然后將裝有樣品的小燒杯放入，在放入干凈的攪拌子，以最di速度攪拌。

8、 用 Beckman Type 55.2 Ti 轉頭 115，000g 4℃離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應該一致。

9、 小心移棄上清，在沉淀中加入 2 mL 溶液 A，充分吹打混勻。

10、用 Beckman Type 55.2 Ti 轉頭 115，000g 4℃離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應該一致。

11、小心移棄上清，所得沉淀放-20℃長期保存或溶解在 1 mL 自備的，跟后續實驗兼容的緩沖液（如 1×等電點電泳上樣液，可從本公司購買），所得膜蛋白的濃度在 1mg/mL 左右。

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