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在共聚焦顯微鏡中，測(cè)定共定位的能力受限于光學(xué)系統(tǒng)的分辨率及用于照明樣品的入射光波長。寬場熒光和共聚焦顯微鏡理論分辨率約為200nm，但在實(shí)際上，由于各種原因這個(gè)數(shù)降到400nm和600nm之間，原因包括顯微鏡光路未*對(duì)準(zhǔn)、光學(xué)折射率波動(dòng)、光學(xué)像差及樣品制備的不合適。然而，對(duì)于一個(gè)已經(jīng)*調(diào)好的共聚焦顯微鏡來說，兩個(gè)熒光分子是否連接到同一個(gè)目標(biāo)對(duì)象上，或者它們是否定位在同一個(gè)器官上受光學(xué)分辨率影響。共定位的許多實(shí)驗(yàn)是圍繞高特異性的合成探針和抗體進(jìn)行的，標(biāo)記目標(biāo)是容易區(qū)分的局部的、明確的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
共聚焦顯微鏡的掃描器內(nèi)密封有檢測(cè)針孔光欄、分光鏡、發(fā)射熒光分色器及檢測(cè)器。當(dāng)熒光樣品中的混合熒光進(jìn)入掃描器，經(jīng)過檢測(cè)針孔欄、分光鏡和分色器選擇后，被分成各單色熒光，分別在不同的熒光通道進(jìn)行檢測(cè)并形成相應(yīng)的共焦圖像，同時(shí)在計(jì)算機(jī)屏幕上可以顯示幾個(gè)并列的單色熒光圖像及其合成圖像。
針孔是共聚焦顯微鏡中的一個(gè)重要組成部分，它是放在檢測(cè)器及激光光源前面的一個(gè)小孔，作用是控制光切片的厚度，對(duì)實(shí)現(xiàn)斷層掃描成像，排除焦面雜散光起關(guān)鍵作用；
分光鏡的作用是按照波長來改變光線的傳播方向；
發(fā)射熒光分色鏡的作用是選擇出一定的波長范圍的光進(jìn)行檢測(cè)，不同型號(hào)的儀器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色器的部件主要由濾光片、棱鏡和光柵三種類型；
檢測(cè)器采用高靈敏度的光電倍增管，其檢測(cè)的范圍和靈敏度可根據(jù)強(qiáng)度進(jìn)行連續(xù)調(diào)節(jié)。
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