單細胞RNA測序技術（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）已被廣泛應用于免疫學研究中，通過從單細胞水平解析免疫細胞亞群異質性，極大地促進了我們對免疫相關亞群的理解。調節性T細胞(Regulatory T cells, Treg)是控制免疫穩態*的細胞，具有治療自身免疫的臨床潛力。通過研究得知體外實驗時，一些條件會使部分Treg失去Foxp3轉錄因子的表達，而獲得效應T細胞(Teff)的特性，這一過程被稱為Treg可塑性。免疫應答過程中這種可塑性的程度和可逆性尚不清楚。今天向大家分享一篇近期發表在Science immunology（IF 17.727）上，利用scRNA-seq鑒定Unstable Treg亞群相關研究的文章“Unstable regulatory T cells, enriched for naïve and Nrp1neg cells, are purged after fate challenge”。

技術亮點
1.BD Rhapsody單細胞多組學分析系統
2.Rhapsody 靶向mRNA & AbSeq擴增試劑盒（TTA）
3.BD Abseq寡核苷酸偶聯抗體
4.BD Rhapsody小鼠多樣本標記試劑盒（SMK）
5.BD Rhapsody Analysis Pipeline

研究結果

1.體內微生物生理刺激對ex-Foxp3細胞無誘導作用

研究者在本文中通過構建遺傳誘導命運圖譜小鼠技術(圖1A)驗證ex-Foxp3的產生（圖1B），在微生物/抗原暴露下，無特定病原體的小鼠（SPF）與野生型小鼠（Co-house）體內都會產生數量相近、性能一致的ex-Foxp3細胞（圖1C-J）。

 
2. 發現ex-Foxp3細胞是Treg中的一群unstable Treg亞群

通過遺傳誘導命運圖譜小鼠過繼轉移模型驗證，發現ex-Foxp3細胞是Treg中的一群unstable Treg亞群（圖2A，B，D），會在免疫缺陷的狀態下轉化生成(圖2F)
 

圖2 Ex-Foxp3細胞的形成是非隨機事件，體內unstable亞群清除后Treg的穩定性升高

3. Ex-Foxp3細胞對Treg表達的譜系無命運記憶
 進一步通過體外Treg極化條件下培養ex-Foxp3細胞（圖3A，B）、以及通過改進的遺傳誘導命運圖譜小鼠過繼轉移模型進行體內驗證（圖3C-F），發現該ex-Foxp3細胞會持續保持炎癥效應，而且對Treg表達的譜系再無命運記憶（圖3）。

圖3 在體外和體內，ex-Foxp3細胞表現出有限的命運記憶

4. 單細胞多組學技術鑒定潛在的Unstable Treg亞群

BD Rhapsody單細胞多組學技術：TTA（214）+Abseq（5）+SMK

即使損傷改善后、炎癥環境消除，ex-Foxp3細胞炎癥狀態也會持續存在，所以能表征出這個原始異質性的Treg亞群很重要。

基于流式技術獲取的動力學數據，研究者評估了Foxp3缺失前Tregs基因表達的變化, 選取Tregs (未處理的Foxp3YFP-CreRosaRFP 命運圖譜小鼠中獲取的CD4+ YFP+ RFP+細胞)和將Foxp3YFP-CreRosaRFPTregs和同源naïve T細胞共轉移到Rag1KO（免疫缺陷型）小鼠體內后在第5, 10, 和 15天獲取 CD4+ YFP- RFP+ ex-Foxp3細胞(圖4A和圖S10A)。降維聚類(UMAP)分析產生6個細胞亞群(圖4B)。Foxp3基因在所有ex-Foxp3細胞群體中均無表達，與分選報告相對應(圖4C)。依據不同時間點樣本進行差異表達分析，發現了三大類基因:快速丟失基因（Treg相關marker）、瞬時富集基因（穩定性喪失中起主要作用的基因）和后期富集基因（高度激活的表型相關基因）(圖4D)。

圖4（A-E） 單細胞多組學技術鑒定潛在的Unstable Treg亞群

為了深入了解不穩定Treg亞群的起源，研究者進行了基于Pearson相關關系的網絡分析(r 0.95)，以識別第0天與第5天ex-Foxp3細胞最相似的Treg(圖4F)。Inter Treg被確定為富含Unstable Treg的候選亞群，該亞群表達了88%的Treg特征基因，因此Inter Treg群體仍然代表真正的Treg。

圖4（F） 單細胞多組學技術鑒定潛在的Unstable Treg亞群

Inter Treg富集了naïve Nrp1- Treg(圖4G)，流式細胞儀顯示類似，脾臟naïve細胞富含Nrp1- Treg (圖4H)。在22%的第0天Treg中檢測到Nrp1的表達（依據共表達基因為基礎，可推斷出占群體的89%），只有13%的Inter Treg細胞和7%的第5天ex-Foxp3細胞中檢測到Nrp1 (圖4I)。然而，在Inter Treg亞群中分為Nrp1+和Nrp1neg兩組，Nrp1+和Nrp1-細胞與第5天ex-Foxp3細胞的關聯性都很高，而與第10天ex-Foxp3細胞的關聯性很少(圖4I右圖)。第5天ex-Foxp3細胞表達高水平CD62L(圖4E)。在所有Inter Treg差異表達的基因Nrp1在CD62Lhigh部分中特異下調。總之，這些數據提出了一個假設，naïve Nrp1- Treg是異質性Treg細胞群中存在的亞群，在淋巴細胞降低的環境下最容易轉化。

圖4（G-I） 單細胞多組學技術鑒定潛在的Unstable Treg亞群
 

5. 淋巴細胞減少后pTreg和tTreg中unstable Treg亞群分析

Nrp1表達缺失被認為是外周誘導的Tregs (pTregs)富集的原因。通過BAC-Foxp3Cre-GFP改進的遺傳誘導命運圖譜小鼠過繼轉移模型, 將Treg亞群作為一個整體進行流式分選：BAC(GFP)+ Foxp3(Thy1.1)+亞群(tTregs，胸腺來源型Tregs)；BAC(GFP)- Foxp3(Thy1.1)+亞群(pTregs，外周誘導型Tregs)（圖5B）。驗證發現，與tTregs相比，pTregs中富含unstable Treg（圖5C）。活化狀態不影響Nrp1- Treg的不穩定性（圖5E）。但從ex-Foxp3細胞群形成的絕對數量來看，這兩個Treg來源的ex-Foxp3百分比幾乎貢獻值同等(圖5F)，并且tTreg部分的不穩定性可能主要源于早期和不*確立的新的胸腺轉移細胞（RTE）Treg（圖5D）。

圖5 淋巴細胞減少后pTreg和tTreg中unstable Treg亞群分析

單細胞多組學平臺
BD Rhapsody™
BD Rhapsody™ 單細胞多組學分析系統能夠對成千上萬個單細胞的蛋白與基因進行數字定量，提供靈活的定制化Panel及標準化應用方案，以滿足不同的實驗需求，其*的混樣技術可有效節約時間與成本。

系統組成包括：
BD Rhapsody™ 掃描儀
BD Rhapsody™ 上樣臺
BD Rhapsody™ cartridge（微孔板）   
分子標簽試劑和文庫制備
全轉錄組檢測試劑盒/靶向RNA檢測試劑盒/定制試劑盒
Abseq蛋白檢測試劑盒
多樣本混樣檢測試劑盒
VDJ檢測試劑盒
單細胞測序數據分析軟件BD SeqGeq