一般酶標儀的測定波長在400～750nm或800nm之間，可以滿足ELISA的顯色測定。ELISA試劑盒所使用的標記用酶均為辣根過氧化物酶(HRP)，底物通常為四甲基聯苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過氧化氫溶液的存在下，經HRP作用，分別氧化為2，2，—二氨基偶氮苯(DAB)和聯苯醌。當pH值為5.0左右時，DAB在450nm波長處有最大吸收，當pH值降為L0時，最大吸收波長移至492nm，同時摩爾消光系數變大，顯色加深，因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應。TMB的氧化產物聯苯醌在波長450nm處有最大消光系數，如果HRP量少，H：O：和TMB過量時，則形成藍色的陽離子根。降低pH，即可使藍色的陽離子根轉變為黃色的聯苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產物穩定90min。因此，450nm和492 nm兩個波長是目前ELISA測定常用的。各種酶標儀都配有放置濾光片的可自動轉換的部件，可以同時安裝6～8片濾光片，所配備的濾光片均應包括上述兩個波長，有的酶標儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大。