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毛細管電泳在mRNA疫苗研究中的質(zhì)控應(yīng)用指南

來源:上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司   2022年07月18日 09:59  

mRNA,中文譯名“信使核糖核酸”,是由DNA的一條鏈作為模板轉(zhuǎn)錄而來的、攜帶遺傳信息能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類單鏈核糖核酸。以細胞中基因為模板,依據(jù)堿基互補配對原則轉(zhuǎn)錄生成mRNA后,mRNA就含有與DNA分子中某些功能片段相對應(yīng)的堿基序列,作為蛋白質(zhì)生物合成的直接模板。


mRNA 作為基因和蛋白質(zhì)之間的重要橋梁,科學(xué)家對其的研究也一直沒有停歇。而mRNA 疫苗作為藥物,在近幾年抗擊xinguan的征程中更是大放異彩,輝瑞-BioNTech,莫德納先后推出xinguan疫苗,國內(nèi)眾多醫(yī)藥公司,例如沃森生物-艾博生物,斯微生物等也紛紛做出了不少成績。




質(zhì)控重要性

1.mRNA疫苗的質(zhì)控是為了確保研發(fā)的成品有效性,安全性和可靠性
2.從早期研發(fā)到生產(chǎn)中,原材料,加工流程以及配方輔料等都有可能會發(fā)生變化,因此更需要可靠的質(zhì)控方法來確保成品的質(zhì)量
3.如果不能及時發(fā)現(xiàn)質(zhì)量問題,導(dǎo)致嚴重的臨床試驗結(jié)果,會對消費者(患者)產(chǎn)生重大的安全隱患,會影響藥物的審批
4.不合格的樣品可能會導(dǎo)致
①不正確的PCR 擴增
②質(zhì)粒線性化不佳
③低質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
④RNA產(chǎn)物中存在DNA殘留
⑤降解的RNA


mRNA疫苗質(zhì)控的指導(dǎo)原則
我國在2020年頒布的《xinguan病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》和2022年3月美國藥典USP頒布的《Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality》  上都明確指出了mRNA疫苗質(zhì)控的要求和基本解決方案,科學(xué)家們可以作為參考。



表 1 mRNA疫苗質(zhì)控指標和方法(參考:《Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality》)



毛細管電泳在mRNA疫苗質(zhì)控的應(yīng)用
接下來,魯大師就參考這兩份重要指導(dǎo)原則給大家介紹毛細管電泳法進行mRNA疫苗質(zhì)控的方法。

DNA模板質(zhì)控
檢測時間點:模板PCR擴增后

檢測目的:
1.檢測PCR產(chǎn)物濃度和片段長度,檢測我們的目的DNA是否已經(jīng)被擴增
2.檢測是否有鹽粒子污染

評判依據(jù):
成功的PCR顯示為單峰,如果模板降解這會顯示多峰。
若基線不平整或者有釘子峰表示存在高鹽離子,若鹽粒子濃度高達100-200nM,會抑制mRNA 轉(zhuǎn)錄。



圖 1 正確的模板示意圖:如黑色峰圖顯示質(zhì)粒DNA,有插入片段峰,且長度在預(yù)期范圍。


RNA體外轉(zhuǎn)錄IVT 質(zhì)控
檢測時間點:體外轉(zhuǎn)錄純化后
檢測目的:檢測目的mRNA 轉(zhuǎn)錄是否成功,沒有發(fā)生降解;是否有模板DNA殘留
評判依據(jù):mRNA和DNA 片段大小不同


1.模板殘留



2.mRNA完整性



圖 2 出現(xiàn)雜峰多峰表明RNA 發(fā)生降解


質(zhì)控儀器和產(chǎn)品

看到這里屏幕前的你一定很好奇,什么樣的儀器適合做毛細管電泳來做mRNA疫苗質(zhì)控呢? 在這個領(lǐng)域,安捷倫是當之無愧的king。美國更是直接把安捷倫的毛細管電泳寫進了這次的mRNA疫苗指南,一整個的大安利。 而安捷倫的儀器也是陪伴著輝瑞疫苗從研發(fā)到生產(chǎn)的全過程。



安捷倫有兩款毛細管電泳儀器,都非常適合!
1.芯片式毛細管電泳-------安捷倫2100生物分析儀
2.陣列式毛細管電泳-------安捷倫片段化分析儀(5200,5300和5400)



配套試劑

貨號產(chǎn)品名配套試劑特點
5067-1511RNA 6000 Nano 試劑盒2100生物分析儀用于對濃度介于 25–500 ng/µL 之間的總RNA和 mRNA 樣品進行分析與定量
5067-1513RNA 6000 Pico 試劑盒2100生物分析儀高靈敏度RNA分析,用于濃度低至 50 pg/µL總RNA或 250 pg/µL mRNA的低豐度 RNA 樣品分析
DNF-471-0500RNA 試劑盒 (15NT)片段化分析儀用于定性和定量分析 200 至 6000 nt 的總RNA。包括運行500個樣品所需的試劑
DNF-472-0500HS RNA 試劑盒 (15NT)片段化分析儀用于定性和定量分析低濃度下 200 至 6000 nt 的總 RNA。包括運行500個樣品所需的試劑



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