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磁珠提取實時熒光定量PCR異常擴增曲線分析

來源:鄭州安圖生物工程股份有限公司   2022年07月11日 16:49  
  磁珠提取實時熒光定量PCR是現代分子生物學研究中*的手段,是一種敏感的放大系統。相比于傳統的臨床診斷方法,核酸診斷是分子水平上的診斷技術,可以彌補傳統臨床診斷方法的某些缺陷。
 
  磁珠提取實時熒光定量PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性,而且由于應用了熒光探針,可以通過光電傳導系統直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化以獲得定量結果,所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術的高準確性,克服了常規PCR的許多缺點。
 
  將傳統PCR檢測模式中的PCR擴增和檢測相結合(即在同一個密閉容器中將PCR擴增反應與熒光標記探針檢測結合在一起)檢測目的核酸的檢驗方法紛紛出臺。這樣的檢測方法稱為“實時”PCR,表示PCR擴增產物可被實時檢測。
 
  準確地說,“實時”是指在每一個PCR循環后檢測擴增產物,當PCR擴增反應結束后,我們可以得到每個樣品的PCR擴增產物變化曲線。通過分析這些反應曲線,不但可以得到病原體的定性檢測結果,還可以對病原體的數量進行準確定量。
 
  多組分圖擴增曲線沒有抬升,是很明顯的陰性樣本,但是擴增圖譜的擴增曲線抬升了,這樣就會與閾值線相交,反而有了CT值。這是由于軟件在進行基線自動扣除的時候出現錯誤,引起了擴增曲線抬升。
 
  出現這種情況可以采取手動調整基線的方法,重新定義基線即可正常,即將基線起點改為熒光信號穩定的循環數(一般是3),基線終點要改成擴增曲線起峰的前一個循環數(比如起峰是在第25個循環,那基線的終點就是24)。引起這樣的原因是由于選用的耗材、試劑或者操作的原因導至背景熒光信號有所波動,從而造成反應孔的自動基線扣除錯誤。

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