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Rat VEGF164, His tag 重組大鼠源血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，His-標(biāo)簽（VE
大鼠滑膜細(xì)胞的制備方法：
滑膜細(xì)胞的培養(yǎng)：將分離的滑膜組織用含青霉素200kU/L、鏈霉素200mg/L的D-Hank's液漂洗3次以減少污染機(jī)會(huì)；去掉脂肪組織，將16個(gè)滑膜組織樣本平均分為A、B兩份。將A份不加處理分為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8八個(gè)樣品，將B份用手術(shù)剪剪碎后分為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8八個(gè)樣品。分別采取4種不同方法進(jìn)行處理。
1)不加消化酶消化法：分別將A1、A2、B1、B2離心洗滌2次(2500r/min，離心6min)，吸棄上清液，加入100μL100%的FBS混勻，用移液槍吸出注入培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱烘干15min，再將A1、B1加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS吹打均勻，A2、B2用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS。
2)加Ⅱ型膠原酶消化法：將A3、A4、B3、B4離心洗滌2次(2500r/min，離心6min)，吸棄上清液，吸取膠原酶Ⅱ至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱消化，觀察組織成絮狀后，加入1mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS終止消化，用移液槍吸出，移入離心管離心(2500r/min，離心6min)，棄上清液，放入培養(yǎng)瓶中，A3、B3加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS，吹打均勻；A4、B4用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS。
3)加胰蛋白酶消化法：將A5、A6、B5、B6離心洗滌2次(2500r/min，離心6min)，吸棄上清液，吸取胰蛋白酶至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱消化，觀察組織成絮狀后，加入體積分?jǐn)?shù)20%FBS終止消化，用移液槍吸出，移入離心管離心(2500r/min，離心6min)。棄上清液，放入培養(yǎng)瓶中，A5、B5加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS，吹打均勻；A6、B6用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS。
4)先加Ⅱ型膠原酶消化法再加胰蛋白酶消化：將A7、A8、B7、B8離心洗滌2次(2500r/min，離心6min)，吸棄上清液，吸取膠原酶Ⅱ至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱消化，觀察組織成絮狀后，取出培養(yǎng)瓶，仔細(xì)吹打使組織塊分散，將未黏附細(xì)胞移入離心管離心(2500r/min，離心6min)，棄上清液，再加D-Hank's液洗滌，離心，吸棄洗滌液，重復(fù)離心3次，吸取胰蛋白酶至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱消化，消化結(jié)束取出培養(yǎng)瓶，加入體積分?jǐn)?shù)20%FBS終止消化，用移液槍吸出，移入離心管離心(2500r/min，離心6min)。棄上清液，放入培養(yǎng)瓶中，A7、B7加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS，吹打均勻；A8、B8用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS。
5)結(jié)果：培養(yǎng)9d后，觀察各培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的成活個(gè)數(shù)和生長(zhǎng)狀況，組織剪碎不加消化酶人工貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞得數(shù)為2.03×106，是所有培養(yǎng)方法中細(xì)胞的數(shù)最多的。細(xì)胞活力為95%，與組織剪碎加膠原酶Ⅱ消化后人工貼壁培養(yǎng)同為各種培養(yǎng)方法中細(xì)胞活力*強(qiáng)的，綜合考慮*方法為組織剪碎不加消化酶人工貼壁培養(yǎng)。
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