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反相色譜柱是指利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相，根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣，RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，RPC固定相表面*被非極性基團(tuán)所覆蓋，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的疏水性。因此，必須用極性有機(jī)溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離。
反相色譜柱在使用前，醉好進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照C4反相色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（出廠測(cè)試所使用的條件是醉佳條件），只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
①醉好使用流動(dòng)相溶解樣品。
②使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
③使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動(dòng)相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：
①流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中（或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中）。
②流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果;降低柱壓降，延長(zhǎng)泵的使用壽命（可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度）。
③流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，醉好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
④流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
⑥在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動(dòng)相流速的選擇
因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的C4反相色譜柱，要追求醉佳柱效，醉好使用醉佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的C4反相色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。
當(dāng)選用醉佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間（如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量）。
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