標簽：熒光素 細胞轉染 熒光強度   熒光檢測 啟動子 

  螢火蟲可以在螢光素酶的存在下將螢光素轉化為氧化螢光素以發光。利用熒光素酶的較常見的科學測定是報告基因測定，其中可以通過測量來自熒光素酶反應的光信號來跟蹤轉錄激活或抑制。建議使用雙熒光素酶系統，其中發生二次生物發光反應。第二個信號由另一個分子發出。最常見的是由也可以生物發光的海腎基因編碼（一些質粒已經包含海腎和螢光素酶基因，例如 Promega 的 pmirGLO）。這允許您將熒光素酶表達標準化為對照并測量您的相對轉染效率。

熒光素酶檢測過程中的注意事項：
1.信號問題：無信號或低信號。
    這可能歸于轉染問題。我會先檢查你的質粒的質量。確保您具有轉染質量的 DNA正常的小量制備柱通常會攜帶更多的內毒素和鹽，這些內毒素和鹽可能會抑制您的細胞轉染或導致細胞死亡。
    有些細胞難以轉染。建議對使用的每個細胞系，對 DNA 和轉染試劑的量進行滴定實驗。顯然，作為您的標準化對照，使用的海腎質粒的量應始終保持不變。
2.DNA 量：通常您要評估對照質粒與實驗質粒，由于添加了實驗序列，這些質粒的大小可能不同。即使您將相同量的 DNA 轉染到每個孔中，每個孔獲得的 DNA 總量也可能不同，因為您轉染的摩爾比不同。
例如：
來自 2000 bp 質粒的 1 µg DNA 是 0.76 pmoles DNA
來自 3000 bp 質粒的 1 µg DNA 是 0.51 pmoles DNA。
較大的質粒每克含有較少的 DNA 摩爾數！因此，您需要轉染更大質粒的更多 DNA，才能轉染與小質粒相同數量的 DNA。為了使轉染的 DNA 量標準化，許多人使用“填充”DNA，例如 pUC19 質粒（在哺乳動物細胞中沒有功能）。
例如，要測試不同數量的熒光素酶質粒但保持總 DNA 相同，您可以執行以下操作：

3.時間：您可能錯過了可視化效果的窗口。細胞通常在轉染后 24 – 48 小時進行檢測，但這在很大程度上取決于細胞機器表達您感興趣的基因所需的時間。可以以優化轉染后孵育時間的時間過程來決定檢測細胞的合適時間點。
4.信號太強：飽和度：雖然高的信號可能被視為陽性，但您還需要確保您處于檢測和光度計的動態范圍內，并且不會使信號飽和。如果您有較高的值，則您可能使用了過多的 DNA。
啟動子強度：此外，您可能需要更改質粒。如果您使用非常強的啟動子，例如 CMV 或 SV40，這也可能會使您的信號飽和。某些應用（例如，如果您正在測量 miRNA 阻斷結合位點的能力）需要較弱的啟動子，因為您所看到的效果可能比轉錄阻遏元件的效果非常輕微。

重復之間的差異：
同一實驗的孔之間的差異表現在：
1.移液：孔獲得的液體量的微小變化會極大地影響轉染和熒光素酶測定的執行方式。熒光素酶檢測對此較為敏感！建議為您的轉染反應制作預混液（即使它只是用于重復的 3 個孔）。對于每個組合，您應該始終至少有 2 次重復，最好是 3 次。
2.酶標板：另一個問題可能是你的酶標板。來自相鄰孔的背景發光會干擾您的實驗。建議您在白壁或不透明板中進行熒光素酶檢測。但是，您無法在白色孔板中看到您的細胞，因為它們是*白色的！
3.實驗之間的變異（生物變異）
    應該重復多次實驗，以確保您測量的效果是可重復的，因此有可能與生物學相關。然而，我們注意到細胞進行轉染的能力在很大程度上取決于它們的匯合度，尤其是貼壁細胞。轉染依賴于細胞表面接觸，過度融合的細胞可能轉染效率較低。不要假設如果您接種相同數量的細胞，它們每次都會以相同的方式沉淀在板的底部！從而致使細胞結塊。嚴重地影響您細胞的轉染效率和熒光素酶的檢測結果。