大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書

MaxiGel Extraction Kit

貨號：  K0518

保   存：  室溫

組分說明

Cat.No.                         K0518

KitSize                          50

BufferPG                       100ml

BufferPS                        15ml

BufferPW（concentrate）          10ml

BufferEB                        10ml

SpinColumnDL                  50

CollectionTube（2ml）          50

產品簡介

     本試劑盒采用新型硅基質膜技術，通過快速，簡單的結合-洗滌-洗脫步驟可從大量普通或低熔點瓊脂糖凝膠中回收純

化 50bp-50kb 的 DNA 片段，溶膠速度快，每個吸附柱最高可吸附 30 μg 的 DNA，純化過程中有效去除引物、核苷酸、

酶、礦物油、瓊脂糖等雜質，獲得高純度，完整性好的 DNA 片段，回收率高達 90%。本試劑盒回收純化的 DNA 可直接用

于測序、連接和轉化、酶切、標記、體外轉錄等分子生物學實驗。

注意事項

1..第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明在BufferPW中加入無水乙醇。

2.使用前請檢查BufferPG是否出現結晶或者沉淀，如有結晶或者沉淀現象，可在37℃水浴幾分鐘，即可恢復澄清。

3.電泳時最好使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳和回收效果。

4.切膠時，紫外照射時間應盡量短，以免對DNA造成損傷。

5.回收率與初始 DNA 量和洗脫體積有關。

6.所有離心步驟均為使用常規臺式離心機室溫下進行離心。

自備：無水乙醇，離心管

操作步驟

1. 將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分），放入干凈的離心管（自備）中，稱取重量。 

注意：若膠塊的體積過大，可將膠塊切成碎塊。

2. 向膠塊中加入3倍體積Buffer PG；當瓊脂糖凝膠濃度>2%時，建議使用6倍體積BufferPG（如凝膠重為100mg，其體積可視為100μl，依此類推）。

3. 50℃孵育10分鐘，其間不斷溫和地上下顛倒離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可再補加一些溶膠液或繼續放置幾分鐘，直至膠塊*溶解。

注意：1）在膠充分溶解后檢測pH值，若pH值大于7.5，可向含有DNA的膠溶液中加10-30μl 的3M醋酸鈉（pH5.0）將pH值調到5-7。

      2）膠塊*溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因為吸附柱在較高溫度時結合 DNA 的能力較弱。

4.（可選步驟）當回收片段<500bp或>4kb時，應加入1倍膠體積的異丙醇，上下顛倒混勻（如凝膠為100mg，則加入100μl異丙醇）。

注意：當回收片段為500bp-4kb時，加入異丙醇不會影響回收率。

5.柱平衡：向已裝入收集管（CollectionTube）中的吸附柱（SpinColumnDL）中加入200  μl Buffer PS，12,000rpm（~13,400×g）離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6.將步驟3或者步驟4所得溶液加入到已裝入收集管的吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

注意：吸附柱容積為700μl，若樣品體積大于700μl 可分批加入。

7.（可選步驟）向吸附柱中加入500μlBufferPG，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

注意：如果后續實驗用于直接測序、體外轉錄或顯微注射，推薦用此步驟以除去所有凝膠。8. 向吸附柱中加入650 μl Buffer PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

9. 注意：如果純化的DNA用于鹽敏感的實驗（例如平末端連接或直接測序），建議加入BufferPW靜置2-5分鐘再離心。12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘，以*晾干。

注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續的酶促反應（酶切、PCR等）。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱開蓋，置于室溫放置數分鐘，以*晾干吸附材料中殘余的乙醇。

10.  將吸附柱放到一個新離心管（自備）中，向吸附膜中間位置懸空滴加100 μl Buffer EB（pH 8.5），室溫放置2分鐘。12,000rpm離心2分鐘，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。注意：1） 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應保證其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH將水的pH值調到此范圍）。

2） 為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，重復步驟10。

3） 洗脫體積不應小于50μl，體積過少會影響回收效率。

4） 如果使用TE洗脫，需要考慮其中含有的EDTA是否會影響后續的酶促反應。

5）回收大于10kb的DNA片段時，BufferEB應在50℃水浴中預熱，適當延長吸附和洗脫時間，可增加回收效率。

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