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LabChip AAV衣殼蛋白分析助力基因治療藥物研究

來源:上海瑋馳儀器有限公司   2022年05月31日 13:45  

重組腺相關(guān)病毒有組織特異性高、安全性好、免疫原性低等等優(yōu)點,目前被作為基因治療中常用的病毒載體。行業(yè)內(nèi)常采用三質(zhì)?;蚨|(zhì)粒系統(tǒng)進行細胞轉(zhuǎn)染,進而獲得不同血清型的重組AAV載體。其中Cap基因編碼VP1、VP2和VP3三種衣殼蛋白和組裝激活蛋白。VP1與病毒從體內(nèi)逃逸有關(guān),對感染性至關(guān)重要;VP2對于組裝或者感染不可少;VP3核心保守序列β-桶結(jié)構(gòu)決定了不同血清型AAV與宿主細胞作用受體的差異,三者組裝成直徑約25nm的二十面體病毒顆粒,形成病毒衣殼,充當(dāng)病毒基因傳遞載體。
 


圖1:AAV病毒及組成示意圖


AAV衣殼屬性是影響病毒感染活性和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因素,其比例、鑒別、純度、空殼率影響藥物效能和效價強度。因此在基因治療產(chǎn)品的整個開發(fā)過程中,需要對AAV衣殼的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及其蛋白質(zhì)組成進行充分表征和監(jiān)測,為確保藥物的安全性和有效性。ELISA、免疫印跡法常用于確定功能和組成信息,但是無法做到AAV衣殼蛋白的表征。SDS-PAGE和銀染常用于衣殼蛋白研究,但是檢測時間較長,且常常發(fā)生凝膠過熱、過載、染色/脫色標(biāo)準(zhǔn)化不足等問題,導(dǎo)致實驗結(jié)果的誤差,檢測通量不大。此外,分析型超速離心方法(AUC)方法和質(zhì)譜方法也被用于VP蛋白分析,但分析通量有限。因此,行業(yè)內(nèi)亟需尋找一種高通量、、靈敏的方法,用于衣殼蛋白組成、純度、比例及糖基化等表征。
 

PerkinElmer LabChip GXII Touch微流控毛細管蛋白分析系統(tǒng)配套ProteinEXact芯片和試劑盒被廣泛用于AAV衣殼蛋白分析。65秒內(nèi)運行150 nl樣品即可完成樣品分析。靈敏度比銀染靈敏度高一個數(shù)量級,可低至0.2ng/uL。作為一種全自動和高通量的檢測方法,為AAV顆粒質(zhì)量研究帶來了一種定量和可重復(fù)的方法。其檢測原理是:帶電荷樣品在電場中遷移,結(jié)合的熒光基團會被LIF檢測器檢測。一張芯片整合了SDS-PAGE的所有流程:上樣,分離、染色、脫色和檢測,直接從96 孔板或384孔板采樣,通過軟件即可快速實現(xiàn)蛋白或核酸分析,使用方便且可無人值守,化繁為簡,同時檢測通量和數(shù)據(jù)質(zhì)量,具有定量研究AAV蛋白的潛力。是一種快速、定量且可重復(fù)的AAV分析替代方案,目前已用于蛋白分子量、純度、比例和穩(wěn)定性分析、糖基化以及AAV血清型分析等等。
 


圖2:PerkinElmer LabChip GXII Touch儀器及工作原理 A.儀器外觀圖;B.芯片及進樣針;C.熒光圖像顯示蛋白質(zhì)如何在微流體通道中分離和脫色;D. ProteinEXact試劑盒

 

衣殼蛋白純度、比例研究

實驗人員使用PerkinElmer LabChip GXII Touch系統(tǒng)對AAV8衣殼蛋白進行了定量分析,并對VP1、VP2、VP3和雜蛋白大小、分布、濃度和含量百分比進行了計算。該結(jié)果可以與文獻報道的純化樣品SDS-PAGE銀染結(jié)果進行了直觀比較。
 


圖3:變性的AAV8微流控毛細管電泳結(jié)果與精純方法SDS-PAGE銀染對比結(jié)果

 

那么,該系統(tǒng)檢測重復(fù)性如何呢?在對同一樣品進行12次重復(fù)實驗后發(fā)現(xiàn),該系統(tǒng)對VP1、VP2、VP3檢測具有良好重復(fù)性。取12次實驗的VP1、VP2和VP3濃度的平均值,比值為1:1.7:11.3,與預(yù)期比例1:1:10接近。



圖4:變性AAV8的12次重復(fù)實驗數(shù)據(jù)匯總

 

AAV血清型分析

通過對VP1、VP2和VP3峰的分析,還可以用于AAV血清型確認。實驗中前處理必須確保衣殼蛋白解離,以便于血清型分析?;诟鞣N血清型AAV的VP分子量大小和組成差別,可以通過LabChip GXII系統(tǒng),對AAV2、AAV5、AAV8血清型進行了良好的區(qū)分。
 


圖5.不同的AAV血清型(AAV2、AAV5、AAV8)衣殼蛋白微流控毛細管電泳峰圖

 

穩(wěn)定性及聚體動態(tài)研究

AAV衣殼蛋白解離溫度不同,因此AAV的穩(wěn)定性也不相同。在對AAV2、AAV8和AAV9的空殼研究實驗中,樣品加入SDS80℃反復(fù)加熱充分破壞衣殼,使用PerkinElmer LabChip GXII毛細管電泳系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)解離的AAV8顆粒有三個峰,部分破碎的衣殼可以形成不同蛋白質(zhì)分子量聚集體:單體,二聚體,三聚體等混合物以及完整顆粒。該系統(tǒng)的檢測時效性和通量可以為衣殼解離或組裝動態(tài)研究提供了極大的便利和數(shù)據(jù)支撐。
 


圖6.AAV8熱穩(wěn)定動力學(xué)數(shù)據(jù)(a-二聚體和三聚體同時存在;b-只有二聚體存在)

 

AAV糖基化分析

衣殼蛋白的翻譯后修飾對病毒感染嗜性和免疫原性有較大的影響。在以上峰圖中也可以清楚看到了VP3的“肩峰”,這個跟文獻報道一致,Sara等也發(fā)現(xiàn)了AAV2衣殼蛋白的糖基化,并推測了衣殼蛋白表面的四個糖基化位點。為了證實該推測,研究人員對AAV2,AAV8和AAV9衣殼蛋白進行了PNGaseF酶切去糖基化。結(jié)果顯示去糖基化前后的確有分子量變化,處理前分子量VP1、VP2、VP3分別為115kDa、94kDa、81kDa,處理后為113kDa、92kDa、79kDa,大約減小2kDa,與附著在衣殼蛋白上的聚糖的平均分子量一致。凝膠圖上酶切前后分子條帶也顯示了位移。Aloor等的報道在AAV8中發(fā)現(xiàn)了多個N-糖基化位點,質(zhì)譜分析鑒定到了N499位點N-糖基化。Mary等對AAV中多種PTM修飾及糖基化位點進行了匯總。
 


圖7.AAV8衣殼蛋白去糖基化及分析

 

以上,我們介紹了使用PerkinElmer LabChip GXII Touch 微流控蛋白分析系統(tǒng)搭配ProteinEXact芯片和試劑盒進行AAV樣品的分析檢測,證明了該平臺提供病毒蛋白分析的能力,可以為重組病毒顆粒衣殼蛋白組成、比例、純度、糖基化分析提供了一套重復(fù)性高和度好的表征新方法,還為AAV血清型鑒定提供了一種可靠的方法。
 

在PerkinElmer LabChip GXII Touch微流控毛細管蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)上使用ProteinEXact檢測方法,可以實現(xiàn)靈敏度高、重復(fù)性好的蛋白質(zhì)定量和分子量檢測。非常適合于對檢測精度有較高要求的生物制藥上下游樣品分析,以及和基因治療樣品的高分辨率、可對AAV屬性進行重復(fù)性、高通量的表征。此外,該方法還可以用于雙特異性抗體表征分析,這個應(yīng)用我們下一期再來繼續(xù)聊。

 

PerkinElmer LabChip GXII Touch系統(tǒng)特點

  • 標(biāo)準(zhǔn)化、高質(zhì)量的數(shù)字數(shù)據(jù),重現(xiàn)性好

  • 快速高效:1分鐘以內(nèi),比普通CE快45-70倍

  • 可應(yīng)用于多個環(huán)節(jié):表達體系/條件的篩選、純化過程的優(yōu)化、劑型、生產(chǎn)過程及產(chǎn)品放行

  • 可提供多方面的定量數(shù)據(jù):濃度、純度、糖型、聚集體、電荷異質(zhì)性等等

  • 符合相關(guān)法規(guī)要求

  • 領(lǐng)域內(nèi)的用戶已采用并給予高度評價

 

ProteinEXact芯片和試劑盒特點

  • 芯片可重復(fù)使用

  • 上樣量2uL

  • 片段大小性高:<2%

  • 片段大小分辨率高:±10%分子量差異

  • 靈敏度高:0.2ng/μL

  • 樣品分析時間短:65 sec

 

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