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單克隆分離是由單個細胞進行分裂、增殖，形成具有相同遺傳性狀的細胞群體。由于來源于同一個祖先細胞，擴增形成的細胞群還具有十分相近的形態特征和基本一致的生理、生化特性。
是建立穩定細胞系的重要環節，因而在現代生物技術和醫藥研發領域中應用廣泛。構建穩定細胞系的常用方法有質粒轉染法和病毒侵染法，兩種方法都需要借助抗生素篩選，通過單細胞克隆分離最終獲得表型穩定、遺傳特性一致的細胞群。質粒轉染法是通過轉染試劑將質粒dna導入細胞，其中極少部分dna會整合到基因組，通過單細胞克隆分離和抗生素篩選，獲得表達效率高、整合穩定的細胞群，最終構建成穩定細胞系；而病毒侵染法則是通過將攜帶目的片段的病毒，常用的如慢病毒，轉導入細胞，再通過單細胞克隆和抗生素篩選，獲得穩定細胞系。
單克隆分離方法：
a、制備小鼠腹腔細胞。同“細胞融合”一節中的方法。
b、制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，用含20%血清的HT培養基稀釋至每毫升含2.5、15和50個細胞三種不同的稀釋度。
c、按每毫升加入5×104-1×105細胞的比例，在上述雜交瘤細胞懸液中分別加入腹腔巨噬細胞。
d、每種雜交瘤細胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細胞數分別為0.5、3和10。
e、37℃、7.5%CO2濕潤培養7-10天，出現肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。
f、取抗體檢測陽性孔的細胞擴大培養，并凍存。
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