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分享免疫熒光實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

來源:上海撫生實(shí)業(yè)有限公司   2022年05月23日 11:56  

標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展蕞早的一種是免疫熒光,它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù),通過將抗體與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光步驟包括,細(xì)胞固定和通透,封閉,孵育一抗,二抗等。除了這些基本步驟,接下來的實(shí)驗(yàn)方法希望可以幫到您。

1. 細(xì)胞固定和通透

為達(dá)到蕞佳的檢測效果,細(xì)胞需要經(jīng)過固定和通透。步驟很重要,細(xì)胞和抗原需要保證蕞佳的結(jié)構(gòu),并利于抗體與抗原結(jié)合。通常情況下,

2. 抗體特異性

免疫熒光需要用到特異性非常強(qiáng)的抗體,可以避免高背景和不理想的蛋白定位結(jié)果。在大多數(shù)情況下,純化抗體的效果很好,但是正確的對(duì)照可以幫助精-準(zhǔn)定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對(duì)照,有利于減少降低背景干擾。

3. 合適的抗體稀釋比例

通過優(yōu)化抗體稀釋比例來優(yōu)化染色,通常情況下 1ug/ml 的純化抗體或者 1:100-1:1000 的抗血清足夠達(dá)到特異性染色的結(jié)果。但在能保證低背景染色的前提下,可以通過增加濃度來提高信號(hào)強(qiáng)度。如果是第1次使用該抗體或測定某抗原,強(qiáng)烈建議濃度梯度實(shí)驗(yàn)。

4. 優(yōu)化緩沖液和封閉劑

盡管很多抗原在常見的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色,但是對(duì)于某些目的抗原,更換一下含有不同離子的緩沖液,比如鈣、鎂、鉀等,可以帶來很大程度上的改善。Rockland 可提供優(yōu)化過的 IHC 用封閉緩沖液,同樣適用于熒光染色實(shí)驗(yàn)。

5. 選擇正確的二抗

如果您需要做免疫實(shí)驗(yàn),我們強(qiáng)烈建議您選擇進(jìn)行過預(yù)吸附的二抗進(jìn)行單染實(shí)驗(yàn);如果是雙重甚至是多重染色,那么必須使用預(yù)吸附的二抗。同時(shí),請(qǐng)優(yōu)先選擇來自同一物種的二抗。

6. 使用合適的細(xì)胞密度

選擇合適的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行染色,當(dāng)細(xì)胞數(shù)量過多時(shí),細(xì)胞結(jié)構(gòu)不好,導(dǎo)致染色背景深,低細(xì)胞密度,會(huì)使細(xì)胞貼壁不佳,狀態(tài)不好。

7. 多重染色

對(duì)同一樣本進(jìn)行兩個(gè)不同抗原的檢測時(shí),可以用各自的抗體進(jìn)行同時(shí)染色,但要求兩個(gè)一抗的種屬來源不同,標(biāo)記物不同,而二抗的種屬來源需保持一致。

8. 降低背景

高背景是免疫熒光常見的問題,解決此問題可以用二抗來源的正常血清代替 BSA 做封閉液,降低抗體濃度,增加洗滌次數(shù),洗滌至少三次,每次五分鐘,洗滌液為 PBS+0.05%Tween。

9. 封片

作為免疫熒光的蕞后一步,可以提高折射率,保護(hù)樣品。

10. 數(shù)據(jù)分析

觀察整體樣片時(shí),選擇具有代表性的細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析。

以上就是免疫熒光檢測的 10 種方法,希望可以更好的服務(wù)于您的實(shí)驗(yàn),為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航!




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