禽流感病毒H5N1熒光PCR檢測試劑盒

禽流感病毒H5N1亞型核酸檢測試劑盒

（RT-PCR熒光探針法）

【產品概述】

本試劑盒針對AIV-H5N1高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含AIV-H5N1基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。

【試劑盒組成】

【儲存條件及有效期】

-20℃避光保存，避免反復凍融，有效期6個月。

【適用儀器】

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。

【樣本采集、存放及運輸】

u 樣本采集：各類型樣本按照常規方法采集；

u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應避免反復凍融（最多凍融3次）；

u 運輸：采用冰壺或泡沫箱加冰密封進行運輸。

【自備試劑】

核酸提取試劑，如QIAGEN公司的 RNA核酸提取試劑盒，也可選擇其他合適的核酸提取產品。

【使用方法】

注：所有試劑使用前需*解凍，混合均勻，6,000rpm離心數秒后使用。

1. 樣本處理（樣本處理區）

待檢樣本的核酸提取可采用病毒RNA提取試劑盒或自動化核酸提取儀等，具體提取方法請參照相關說明書；陽性對照及陰性對照無需提取，可直接使用。

2. 擴增試劑準備（PCR前準備區）

取N個（N=陰性對照+待檢樣本+陽性對照）PCR反應管，每管分別加入PCR反應液17.5 μl、混合酶液2.5 μl (也可根據每頭份用量計算N+1份PCR反應液、混合酶液所需總量，兩者混勻離心后分裝20 μl至單個PCR反應管)。

將所有PCR反應管于6,000rpm離心30s，轉移至樣本處理區。

3. 加樣（樣本處理區）

在上述的PCR反應管中分別加入待檢樣本RNA提取物、陰性對照和陽性對照各5 μl，蓋緊管蓋，于6,000rpm離心10s，轉移至擴增區。

* 注意事項：建議加樣順序是陰性對照、待檢樣本、陽性對照。

4. PCR擴增（擴增區）

1)儀器設置（以ABI Prism 7500為例）

將PCR反應管放入PCR儀內，按照對應順序設置陰性對照(NTC)、陽性對照(Standard)及待檢樣本(Unknown)。

FAM通道采集AIV-H5熒光信號，HEX通道采集AIV-N1熒光信號。Quencher Dye為None，參比染料(Passive Reference)為 None。

2) 擴增程序

42℃ 10min

95℃ 3min

95℃  5sec

55℃  40sec

95℃  5sec

55℃  40sec

40Cycles中55℃采集熒光信號，反應體系為25 μl。

【結果分析條件設定】

u 基線（Baseline）設定：應選擇該次實驗指數擴增前所有樣本熒光信號比較穩定的一段區域（所有樣本熒光信號無較大波動），起始點（Start）應避開熒光采集起始階段的信號波動，終止點（End）應比最早出現指數擴增的樣本Ct值減少1~3個循環，建議基線設為3~15。

u 閾值(Threshold)設定：將閾值線設定在剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。

【質控標準】

1.   陰性對照的檢測結果應為陰性，Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期；

2.   陽性對照的檢測結果應為陽性，有典型S型擴增曲線或Ct值≤35；

3.   以上要求需在一次實驗中同時滿足，否則該次實驗視為無效。

【結果判斷】

1.   陽性：標本檢測結果Ct值≤35并有明顯指數增長期；

2.   可疑：有明顯的指數擴增期，且35＜Ct≤38，此時樣本為可疑樣本；對于可疑樣本建議復核一次，若復核結果Ct≤38且有指數擴增期，則判定為陽性，否則判定為陰性；

3.   陰性：無指數擴增期，Ct＞38或無Ct值均判定為陰性樣本。

【對檢驗結果的解釋】

【試劑盒使用注意事項】

1.   有關實驗室管理規范請嚴格按照行業行政主管部門頒布的有關基因擴增檢驗實驗室的管理規范執行。

2.   本試劑盒僅用于體外檢測。

3.   實驗請嚴格分區操作：

第一區：PCR前準備區 — 準備擴增所需試劑；

第二區：樣本處理區 — 待測樣本和對照品處理；

第三區：檢測區 — PCR擴增檢測。

4.   各區物品均為專用，不得交叉使用，避免污染，實驗后即請清潔工作臺；

5.   試劑盒內各試劑使用前，充分融化后請稍事離心。

6.   在－20℃保存的樣本裂解產物，應在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。

7.   分裝有反應液的檢測管裝入密實袋內再轉移至樣本區。

8.   加樣時應使樣品*落入反應液中，不應有樣品粘附于管壁上，加樣后應盡快封上檢測管蓋。

9.   擴增完畢立即取出檢測管，密封在專用塑料袋內，丟棄于指定地點。

10.   反應液分裝時應盡量避免產生氣泡，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄露污染儀器。

11.   實驗中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。

12.   工作臺及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進行消毒。

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