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禽流感病毒H5N1亞型核酸檢測步驟

來源:杭州研謹(jǐn)生物科技有限公司   2022年05月19日 14:34  

禽流感病毒H5N1熒光PCR檢測試劑盒

 

禽流感病毒H5N1亞型核酸檢測試劑盒

(RT-PCR熒光探針法)

【產(chǎn)品概述】

本試劑盒針對AIV-H5N1高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含AIV-H5N1基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【試劑盒組成】

組成成份

包裝規(guī)格

AIV-H5N1 PCR反應(yīng)液

875μl

AIV-H5N1混合酶液

125μl

陰性對照

40μl

AIV-H5N1陽性對照

40μl

【儲存條件及有效期】

-20℃避光保存,避免反復(fù)凍融,有效期6個月。

【適用儀器】

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。

【樣本采集、存放及運(yùn)輸】

u 樣本采集:各類型樣本按照常規(guī)方法采集;

u 存放:樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h,-70℃以下可長期保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融(最多凍融3次);

u 運(yùn)輸:采用冰壺或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

【自備試劑】

核酸提取試劑,如QIAGEN公司的 RNA核酸提取試劑盒,也可選擇其他合適的核酸提取產(chǎn)品。

【使用方法】

注:所有試劑使用前需*解凍,混合均勻,6,000rpm離心數(shù)秒后使用。

1. 樣本處理(樣本處理區(qū))

待檢樣本的核酸提取可采用病毒RNA提取試劑盒或自動化核酸提取儀等,具體提取方法請參照相關(guān)說明書;陽性對照及陰性對照無需提取,可直接使用。

2. 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備(PCR前準(zhǔn)備區(qū))

取N個(N=陰性對照+待檢樣本+陽性對照)PCR反應(yīng)管,每管分別加入PCR反應(yīng)液17.5 μl、混合酶液2.5 μl (也可根據(jù)每頭份用量計算N+1份PCR反應(yīng)液、混合酶液所需總量,兩者混勻離心后分裝20 μl至單個PCR反應(yīng)管)。

組分

每頭份用量

AIV-H5N1 PCR反應(yīng)液

17.5 μl

AIV-H5N1混合酶液

2.5 μl

將所有PCR反應(yīng)管于6,000rpm離心30s,轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

3. 加樣(樣本處理區(qū))

在上述的PCR反應(yīng)管中分別加入待檢樣本RNA提取物、陰性對照和陽性對照各5 μl,蓋緊管蓋,于6,000rpm離心10s,轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。

* 注意事項:建議加樣順序是陰性對照、待檢樣本、陽性對照。

4. PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增區(qū))

1)儀器設(shè)置(以ABI Prism 7500為例)

將PCR反應(yīng)管放入PCR儀內(nèi),按照對應(yīng)順序設(shè)置陰性對照(NTC)、陽性對照(Standard)及待檢樣本(Unknown)。

FAM通道采集AIV-H5熒光信號,HEX通道采集AIV-N1熒光信號。Quencher Dye為None,參比染料(Passive Reference)為 None。

2) 擴(kuò)增程序

42℃ 10min

95℃ 3min

95℃  5sec

55℃  40sec

95℃  5sec

55℃  40sec

40Cycles中55℃采集熒光信號,反應(yīng)體系為25 μl。

【結(jié)果分析條件設(shè)定】

u 基線(Baseline)設(shè)定:應(yīng)選擇該次實(shí)驗(yàn)指數(shù)擴(kuò)增前所有樣本熒光信號比較穩(wěn)定的一段區(qū)域(所有樣本熒光信號無較大波動),起始點(diǎn)(Start)應(yīng)避開熒光采集起始階段的信號波動,終止點(diǎn)(End)應(yīng)比最早出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增的樣本Ct值減少1~3個循環(huán),建議基線設(shè)為3~15。

u 閾值(Threshold)設(shè)定:將閾值線設(shè)定在剛好超過正常陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。

【質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)】

1.   陰性對照的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性,Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期;

2.   陽性對照的檢測結(jié)果應(yīng)為陽性,有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35;

3.   以上要求需在一次實(shí)驗(yàn)中同時滿足,否則該次實(shí)驗(yàn)視為無效。

【結(jié)果判斷】

1.   陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35并有明顯指數(shù)增長期;

2.   可疑:有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期,且35<Ct≤38,此時樣本為可疑樣本;對于可疑樣本建議復(fù)核一次,若復(fù)核結(jié)果Ct≤38且有指數(shù)擴(kuò)增期,則判定為陽性,否則判定為陰性;

3.   陰性:無指數(shù)擴(kuò)增期,Ct>38或無Ct值均判定為陰性樣本。

【對檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果

標(biāo)本檢測結(jié)果解釋

FAM

 

+

+

標(biāo)本中檢出AIV-H5和AIV-N1。

+

標(biāo)本中檢出AIV-H5,未檢出AIV-N1。

+

標(biāo)本中檢出AIV-N1,未檢出AIV-H5。

標(biāo)本中未檢出AIV-H5和AIV-N1。

 

【試劑盒使用注意事項】

1.   有關(guān)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范請嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

2.   本試劑盒僅用于體外檢測。

3.   實(shí)驗(yàn)請嚴(yán)格分區(qū)操作:

第一區(qū):PCR前準(zhǔn)備區(qū) — 準(zhǔn)備擴(kuò)增所需試劑;

第二區(qū):樣本處理區(qū) — 待測樣本和對照品處理;

第三區(qū):檢測區(qū) — PCR擴(kuò)增檢測。

4.   各區(qū)物品均為專用,不得交叉使用,避免污染,實(shí)驗(yàn)后即請清潔工作臺;

5.   試劑盒內(nèi)各試劑使用前,充分融化后請稍事離心。

6.   在-20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物,應(yīng)在加樣前置室溫解凍,作短暫離心后使用。

7.   分裝有反應(yīng)液的檢測管裝入密實(shí)袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本區(qū)。

8.   加樣時應(yīng)使樣品*落入反應(yīng)液中,不應(yīng)有樣品粘附于管壁上,加樣后應(yīng)盡快封上檢測管蓋。

9.   擴(kuò)增完畢立即取出檢測管,密封在專用塑料袋內(nèi),丟棄于指定地點(diǎn)。

10.   反應(yīng)液分裝時應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡,上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。

11.   實(shí)驗(yàn)中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi),并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。

12.   工作臺及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒。

 

 

從2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)外包及論文潤色服務(wù),協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤色,是客戶您值得信賴的科研合作伙伴!

如果您受時間、試驗(yàn)條件等限制而無法完成您的課題研究,歡迎您與我們聯(lián)系。

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

 

WB服務(wù)

油紅O染色

透射電鏡服務(wù)

掃描電鏡服務(wù)

RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)

HE染色

細(xì)胞Hochest凋亡染色

石蠟冰凍切片TUNEL凋亡熒光

免疫熒光染色

PAS糖原染色

番紅O固綠染色

 

維多利亞藍(lán)染色

免疫組化(IHC)

免疫細(xì)胞化學(xué)ICC

染色質(zhì)免疫沉淀CHIP

 

染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)

網(wǎng)狀纖維染色銀染

石蠟/冰凍切片TUNEL凋亡

瓊脂糖凝膠電泳

 

EVG染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

CBA流式多因子

Taqman探針合成

酪蛋白酶譜MMP(3/10)

蛋白雙向2D-WB

NF-KB p65活性檢測

內(nèi)毒素清除

細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)

 

細(xì)胞熒光染料標(biāo)記

臨床醫(yī)生、碩博研究生整體課題協(xié)助/設(shè)計

 

 

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