截至2020年，全球共有76個多肽類藥物被批準上市，7000多個活性多肽被發現，約150個多肽藥物進入臨床試驗，在過去20多年中，平均每年被批準的多肽藥物約3個。微球、脂質體、聚乙二醇（PEG）修飾等方法的深入應用解決了多肽藥物穩定性差、體內易降解、半衰期短等成藥性差的問題，促進了多肽藥物的開發利用。多肽藥物藥效廣泛，臨床上以慢性病治療為主，例如罕見病、腫瘤、糖尿病、胃腸道、骨科、免疫、心血管疾病等。國內外藥典將合成多肽類藥物列入化藥的范疇進行雜質的控制。歐洲藥典規定合成多肽含量在0.5%以上的相關雜質需進行定性分析，對含量在1%以上的相關雜質進行定量分析并考察其毒副作用。2007年國家食品藥品監督管理局發布了《合成多肽藥物藥學研究技術指導原則》，指出合成多肽原料藥中工藝雜質的來源和一般化學藥物有所不同，其可能的工藝雜質如：缺失肽、斷裂肽、去酰胺多肽、氨基酸側鏈的不*脫保護所形成的副產物、氧化肽、二硫鍵交換的產物、非對映異構的多肽、低聚物和/或聚合物及合成中所用的毒性試劑和溶劑等。

多肽含有二硫鍵、裸露的氨基和羧基，容易因分子間二硫鍵或氨基羧基間脫水形成共價聚合物。共價鍵形成的聚合物雜質可能存在較大免疫原性風險，在多肽類藥物制劑質量研究和新藥申報中應予以重點關注。質譜分析、氨基酸組成分析和氨基酸序列測定是合成多肽藥物及雜質結構確證最常用的技術手段。

島津解決方案

● 分析儀器

島津液相系統Nexera LC-40 +高分辨質譜儀LCMS-9030

●  分析條件

流動相為水：乙腈：TFA=60:40:0.2

流速：0.5 mL/min等度洗脫

柱溫：25℃

質譜：離子源：ESI（+）掃描范圍：m/z 100 ~5000

多肽藥物應用案例一STN聚合物雜質結構鑒定

圖1. 注射用STN破壞樣品HPLC色譜圖

（UV 210 nm）

圖2. STN聚合物雜質可能的聚合方式

通過STN聚合物雜質精確質量數預測其分子式，結合多肽的質譜峰歸屬對STN聚合物雜質進行結構推測（如圖2）。STN結構中含有一對二硫鍵，綜合判斷其聚合位點為分子間二硫鍵。

多肽藥物應用案例二TJN聚合物雜質結構鑒定

圖3. 注射用TJN破壞樣品HPLC色譜圖

（UV 214 nm）

圖4. TJN聚合物雜質MS2質譜圖

使用島津精確分子式預測工具Formula Predictor對TJN聚合物雜質進行分子式預測，其分子式預測結果恰好相當于兩分子TJN脫水，因此推測其聚合位點為兩分子TJN的氨基端和羧基端縮合生成肽鍵。TJN為20肽，其游離氨基端為苯丙氨酸，游離羧基端為亮氨酸。結合TJN二聚體的推定氨基酸序列進行二級質譜碎片歸屬，TJN聚合物MS2質譜圖中識別出多種特征碎片。特別是y19和b21碎片的存在證明聚合位點為亮氨酸（L）和苯丙氨酸（F）縮合而成的肽鍵。

結論

隨著我國成為國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）成員國，藥品的技術標準逐步與國際接軌。同時隨著我國藥品一致性評價工作的全面開展，合成多肽藥物雜質結構鑒定將面臨巨大的技術挑戰。島津公司采用尺寸排阻色譜法建立合成多肽藥物的聚合物分析方法，并通過高分辨質譜LCMS-9030測定聚合物的準確質量數推測其分子式，同時結合MS/MS特征碎片推測聚合物雜質的結構。本文展示LCMS-9030在多肽藥物的兩種主要聚合方式（二硫鍵和肽鍵）鑒定中的應用。島津液相色譜四極桿飛行時間串聯質譜LCMS-9030具有高質量準確度，高分辨率的性能優勢，是合成多肽藥物雜質一級結構鑒定的強有力工具。

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