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單克隆分離技術主要包括有限稀釋法、克隆環(huán)法和顯微操作法。有限稀釋法是通過將細胞懸液連續(xù)梯度稀釋，使最終在細胞培養(yǎng)板的一個孔中僅有1個細胞，再經(jīng)過兩周左右時間增殖，形成細胞群，再經(jīng)過驗證獲得穩(wěn)定克隆；克隆環(huán)法是通過在10-15cm的細胞培養(yǎng)皿中，將細胞接種低密度,使分散的單個細胞各自增殖成細胞群，用克隆環(huán)方式與周圍的細胞隔離開，通過胰酶消化，轉到新的孔板中繼續(xù)培養(yǎng)擴增，并檢測驗證而獲得穩(wěn)定克隆；顯微操作法是借助顯微鏡，在放大的視野下挑取單細胞，再轉至培養(yǎng)孔中，逐漸擴增獲得單克隆。
這三種方法有各自一定的局限性：有限稀釋法對懸浮細胞較為合適，但是實際中貼壁細胞的需求占絕大多少，而且很多細胞在極低密度下生長極慢甚至不能生長，無法進行單細胞克隆；克隆環(huán)法不僅需要購買克隆環(huán)，而且因為細胞數(shù)量較少時肉眼難辨，必須等到細胞數(shù)量擴增到幾百時才能進行分離，因此需要等待較長時間，而且操作步驟多、難度大，實驗人員通常需要有豐富經(jīng)驗；顯微操作法需要借助昂貴的特殊顯微鏡或將常規(guī)顯微鏡搬至安全柜內使用，操作難度加大，而且易造成細胞污染而前功盡棄。
單克隆分離方法：
a、在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細胞（小鼠腹腔細胞）單層。
b、臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻，配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45℃水浴中溫育。
c、吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml，室溫10分鐘。
d、取雜交瘤細胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層。
e、37℃、7.5%濕潤培養(yǎng)7-14天；克隆生長至2mm時，用毛細吸管吸出克隆，直接轉種于含有飼養(yǎng)細胞的24孔板，擴大培養(yǎng)。
f、吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴大培養(yǎng)、凍存。
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