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CCK-8 | 細胞活性檢測指南

來源:上海陶術生物科技有限公司   2022年04月22日 18:04  

在藥物篩選中,如何高效便捷地評價藥物分子的細胞毒性呢?做細胞實驗的你,還在苦于計算細胞活力嗎?T仔這里有妙招奧
 

? 一、關于細胞活力 ?

細胞活力是細胞的重要指標,其定義為某一細胞群體中活細胞的數量。在藥物篩選的過程中,通常會通過細胞毒性和增殖試驗來測定細胞活力,以評價被試分子是否對細胞增殖有影響或顯示細胞毒性作用。
 
目前已經有多種方法相繼被開發用于檢測細胞活力、分析藥物的細胞毒性和增殖抑制作用,這些方法依賴于不同的細胞功能發揮作用,包括細胞膜通透性、染料攝取、代謝活性、酶釋放、細胞粘附、ATP 產生、輔酶產生、DNA 合成和核苷酸攝取活性等。
 
其中,基于細胞膜通透性原理的染料排除法是best簡便的細胞毒性分析方法。此外,基于細胞代謝的細胞增殖分析方法包括 MTT, XTT, MTS, WST1, Alamar Blue,鈣黃綠素 AM,LDH 釋放檢測,G6PD 釋放檢測。另一方面,基于 DNA 合成或細胞增殖標記物的方法也的得到了廣泛使用,例如 H3 標記胸腺嘧啶核苷,BrdU,PCNA,磷酸組蛋白 H3,Ki-67。此外,ATP 檢測、磺基羅丹明B 測定、細胞克隆形成實驗等也是分析細胞增殖的有效方法。
 
下面我們來看看幾種具體的方法介紹吧。

 

二、細胞活力檢測方法 ?
 

(一)染料排除法 

染料排除法的原理是活細胞能夠將一些染料排除在外而死細胞無法做到,這是因為活細胞具有完整的細胞膜,對于通過膜通道的小分子具有高度的選擇性。

臺盼藍(Diphenyl Blue)是一種帶負電荷的約 960 Da 的重氮染料,它只能透過損壞的細胞膜,被死細胞吸收。這種染料可以在體外使用,如細胞培養;也可以在體內使用,如觀察活體中的癌細胞群;它還可用于比較不同組別在特定條件下的活細胞數量或增殖率。臺盼藍在實驗室的細胞計數中應用廣泛,死細胞染色后在顯微鏡下會變藍,活細胞不染色,且外觀清晰。

盡管這種方法有許多優點,包括經濟、易于應用,但它無法區分細胞凋亡或壞死,且靈敏度非常有限。
 

(二)基于細胞代謝的增殖分析實驗

1.MTT 法

MTT 法基于 MTT 在線粒體 NAD(P)H 依賴型氧化還原酶催化下轉化成不溶性甲瓚,生成的甲瓚可以反映線粒體的活性,并可由此來確定活細胞的數量。增殖細胞具有更高的 MTT 轉化率,而緩慢生長細胞的低代謝率導致了較低的 MTT 轉化率。應用 MTT之后,用 DMSO 或者洗滌劑十二烷基硫酸鈉去溶解甲瓚晶體,甲瓚的濃度便可以利用分光光度計進行檢測,波長范圍為 540 到 720 nm。

MTT 法常用于分析藥物在不同條件或者濃度的細胞毒性作用,也可用于比較藥物組和對照組細胞活力從而測定藥物的 IC50 值,有助于確定藥物的體外作用以及預測臨床應用。另一方面,由于檢測期間會殺死所有細胞,因此該方法可能會對后續的研究帶來不便。此外,它無法區分細胞毒性和細胞抑制作用,在細胞數目較少時結果可信度不高。

MTT 法原理【線粒體 NADH 通過脫氫酶轉化為 NAD+,該反應導致活細胞中的黃色四氮唑鹽(MTT、XTT、MTS 和 WST)還原為紫色的甲瓚晶體。】


2.XTT 法
與 MTT 相同,XTT 也是一種四氮唑鹽,可用于細胞活力的比色分析。XTT 法同樣基于線粒體 NADH 酶可將 XTT 轉化為甲瓚晶體的原理,但與 MTT 法不同的是,XTT 法產生的是水溶性甲瓚晶體,可以直接溶解于培養基中,因此省略了溶解步驟。相比于 MTT 法,XTT 法更易應用且更適用于真菌的研究。此外,有研究認為 XTT 法比 MTT 法更為敏感,相較于其它基于四氮唑鹽的檢測有更大的應用范圍。
 
3.MTS 法
MTS 是在 MTT 和 XTT 之后被報道的另一種四氮唑鹽,它是一種電子偶聯劑,在 5-甲基吩嗪硫酸甲酯即 PMS 存在的情況下會被活細胞中的線粒體還原酶轉化為甲瓚晶體。產生的水溶性甲瓚晶體可以直接溶解在培養基中,無需溶解步驟,可在 490-500 nm 范圍內被檢測。此外,與 MTT 或 XTT 相比,MTS 溶液具有更高的儲存穩定性。MTS 法可用于檢測細胞對各種細胞因子、生長因子、細胞毒性藥物和抗癌藥物的反應。

 

4.?WST 法
水溶性四氮唑鹽即 WST 已被開發為新一代的細胞活性測定化合物,它同樣可在活細胞線粒體中的NADH酶作用下轉化為甲瓚晶體。此外,在 PMS 存在的情況下,WST-1 和 WST-8 比 XTT 及 MTS 結果穩定性更好、檢測靈敏度更高。此外,WST 法無需額外的晶體溶解步驟,其試劑具有即開即用的特點,能夠幫助研究者更快地完成實驗圖片
 
5.乳酸脫氫酶釋放實驗
為了分析藥物對免疫細胞的毒性,研究者開發出了乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放實驗。LDH 是可溶性的細胞質酶,在壞死或凋亡細胞的細胞膜破損之后被釋放到細胞培養基中,因此,檢測 LDH 的活性可以反映藥物或者環境因素的細胞毒性。
 
測定培養基中 LDH 的活性包括兩步:
(1)在 LDH 的催化下,乳酸轉化為丙酮酸,NAD+ 還原為 NADH;
(2)利用產生的 NADH,黃遞酶將四唑鹽即 INT 轉化為紅色的甲瓚產物,出現的甲瓚可在 490-520nm 用分光光度計進行比色測定。甲瓚的水平與培養基中的 LDH 活性呈正相關,可以通過甲瓚的水平來反映 LDH 活性。
 
然而,培養基中的 LDH 水平可能會受到內源性 LDH 活性的污染,并導致產生假陽性的結果,因此該方法需要進一步的確認。此外,LDH 易降解、檢測敏感度不高等缺點限制了該方法的應用。

LDH 釋放實驗

【損傷或死亡細胞釋放的 LDH 催化乳酸氧化為丙酮酸,NAD+ 還原為 NADH 分子。產生的 NADH 被黃遞酶用于將  INT(四氮唑鹽)轉化為紅色甲瓚晶體,并進行比色測量。】

 

(三)腺苷5'-三磷酸測定法
腺苷5'-三磷酸即 ATP ,是生物體的主要能量來源,主要產生于線粒體。ATP 高能磷酸鍵提供的能量能夠用于細胞內所有需要能量的過程。檢測細胞總 ATP 水平可以反映細胞活力以及藥物對細胞的毒性作用。
 
ATP 測定法基于生物發光手段檢測 ATP 水平。通過添加天然的螢火蟲熒光素酶和熒光素在細胞 ATP 參與下發生反應產生熒光,可通過光度計進行檢測。發光的程度與細胞活力呈正相關。
 
與其他方法相比,ATP 測定法具有時間短、靈敏度高、使用范圍廣等優點。發光信號還可以存在較長一段時間,使測量步驟更容易。但由于 ATP 水平的降低與細胞數量、細胞狀態等多種情況相關,因此無法區分藥物的細胞抑制或毒性作用。此外,有研究表明在檢測鉑耐藥上皮性卵巢癌腫瘤對其他藥物的耐藥性或敏感性方面,ATP 檢測法比其他方法更準確。

LDH釋放實驗

(熒光素酶利用細胞 ATP 催化外源性熒光素轉化為氧化熒光素,氧化熒光素產生的熒光被光度計捕捉并測量。)

 

? 三、關于CCK-8 ?

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CCK-8?作原理示意圖


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Fluorescein(熒光素)T1392
Diphenyl Blue(臺盼藍)T18979
Luciferase(熒光素酶)TP1344

 

 

參考文獻:

Adan A, Kiraz Y, Baran Y. Cell Proliferation and Cytotoxicity Assays. Curr Pharm Biotechnol. 2016;17(14):1213-1221.doi:10.2174/1389201017666160808160513

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