在藥物篩選中，如何高效便捷地評價藥物分子的細胞毒性呢？做細胞實驗的你，還在苦于計算細胞活力嗎？T仔這里有妙招奧
 

（一）染料排除法 

染料排除法的原理是活細胞能夠將一些染料排除在外而死細胞無法做到，這是因為活細胞具有完整的細胞膜，對于通過膜通道的小分子具有高度的選擇性。

臺盼藍（Diphenyl Blue）是一種帶負電荷的約 960 Da 的重氮染料，它只能透過損壞的細胞膜，被死細胞吸收。這種染料可以在體外使用，如細胞培養；也可以在體內使用，如觀察活體中的癌細胞群；它還可用于比較不同組別在特定條件下的活細胞數量或增殖率。臺盼藍在實驗室的細胞計數中應用廣泛，死細胞染色后在顯微鏡下會變藍，活細胞不染色，且外觀清晰。

盡管這種方法有許多優點，包括經濟、易于應用，但它無法區分細胞凋亡或壞死，且靈敏度非常有限。
 

（二）基于細胞代謝的增殖分析實驗

1.MTT 法

MTT 法基于 MTT 在線粒體 NAD(P)H 依賴型氧化還原酶催化下轉化成不溶性甲瓚，生成的甲瓚可以反映線粒體的活性，并可由此來確定活細胞的數量。增殖細胞具有更高的 MTT 轉化率，而緩慢生長細胞的低代謝率導致了較低的 MTT 轉化率。應用 MTT之后，用 DMSO 或者洗滌劑十二烷基硫酸鈉去溶解甲瓚晶體，甲瓚的濃度便可以利用分光光度計進行檢測，波長范圍為 540 到 720 nm。

MTT 法常用于分析藥物在不同條件或者濃度的細胞毒性作用，也可用于比較藥物組和對照組細胞活力從而測定藥物的 IC50 值，有助于確定藥物的體外作用以及預測臨床應用。另一方面，由于檢測期間會殺死所有細胞，因此該方法可能會對后續的研究帶來不便。此外，它無法區分細胞毒性和細胞抑制作用，在細胞數目較少時結果可信度不高。

MTT 法原理【線粒體 NADH 通過脫氫酶轉化為 NAD+，該反應導致活細胞中的黃色四氮唑鹽（MTT、XTT、MTS 和 WST）還原為紫色的甲瓚晶體。】

水溶性四氮唑鹽即 WST 已被開發為新一代的細胞活性測定化合物，它同樣可在活細胞線粒體中的NADH酶作用下轉化為甲瓚晶體。此外，在 PMS 存在的情況下，WST-1 和 WST-8 比 XTT 及 MTS 結果穩定性更好、檢測靈敏度更高。此外，WST 法無需額外的晶體溶解步驟，其試劑具有即開即用的特點，能夠幫助研究者更快地完成實驗。

LDH 釋放實驗

【損傷或死亡細胞釋放的 LDH 催化乳酸氧化為丙酮酸，NAD+ 還原為 NADH 分子。產生的 NADH 被黃遞酶用于將  INT（四氮唑鹽）轉化為紅色甲瓚晶體，并進行比色測量。】

LDH釋放實驗

（熒光素酶利用細胞 ATP 催化外源性熒光素轉化為氧化熒光素，氧化熒光素產生的熒光被光度計捕捉并測量。）

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參考文獻：

Adan A, Kiraz Y, Baran Y. Cell Proliferation and Cytotoxicity Assays. Curr Pharm Biotechnol. 2016;17(14):1213-1221.doi:10.2174/1389201017666160808160513