北京大學腫瘤醫院梁軍教授團隊通過 CRISPR 篩選，得到了一種驅動 HCC 細胞對治療藥物產生耐藥機制的方法。并通過這種方法發現 PSTK（磷酸絲氨酰-tRNA激酶）是一種重要的 RNA 依賴性激酶，也是 HCC 細胞對靶向治療產生抗性的關鍵介導因子，可通過抑制鐵死亡誘導起作用。

鐵死亡是一種鐵依賴性的，區別于細胞凋亡、細胞壞死、細胞自噬的新型的細胞程序性死亡方式。其的本質是谷胱甘肽的耗竭、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）活性下降、脂質氧化物不能通過 GPX4 催化的谷胱甘肽還原酶反應代謝，之后二價的鐵離子氧化脂質產生活性氧，從而促使鐵死亡的發生。

因癌細胞比正常細胞利用更高水平的鐵以促進其更具侵襲性的生長，且對鐵誘導劑更敏感，因此，鐵誘導物有望治療腫瘤耐藥，特別是在 HCC 中。

 CRISPR 篩選結果

      PSTK 抑制鐵死亡誘導   

谷胱甘肽過氧化物酶 4 (GPX4) 是鐵中毒的中心調節因子，可減輕鐵中毒過程的毒性。PSTK 是參與硒代半胱氨酸生物合成的關鍵激酶，而硒代半胱氨酸是 GPX 蛋白的活性中心 ，因此 PSTK 的調控可以使 HCC 對靶向治療誘導的鐵離子中毒產生抗性。

肝癌患者 PSTK 過度表達與 Gpx4 表達相關

例如，在使用 Abemaciclib、Sorafenib 或 Erastin 進行靶向治療時，會導致 HCC 細胞中產生明顯的鐵離子信號 (圖AC)，且 PSTK-KO HCC 細胞會顯示較低的 GPXs 和 GPX4 基線活性 (圖D)、PSTK-KO Hep3B 細胞會表現出較高的 ROS 基線水平，并且這些水平在靶向治療后會進一步放大 (圖E)，但是 PSTK 可通過維持 GPX4 的活性來抑制鐵離子的誘導。

PSTK 維持 GPX4 的活性以防止鐵離子誘導

同時，作者通過 RNA-seq 分析，以及對差異表達基因進行 KEGG 富集分析 (圖A) 發現，敲除 PSTK 后，磷酸化鐵蛋白相關基因表達有明顯差異 (圖B) ，嗜鐵基因組呈負富集 (圖C)，與鐵卟啉相關的關鍵保護因子下調 (圖D) 。

綜合代謝組學和 RNA-seq 分析將 PSTK 鑒定為鐵死亡抗性的介質

細胞內氧化磷脂水平顯著增加， GSH（谷胱甘肽）轉化為 GSSG（氧化型谷胱甘肽） 。

代謝物水平變化

GSH 合成過程中的關鍵成分，γ-谷氨酰半胱氨酸、半胱氨酸甘氨酸和半胱氨酸水平顯著降低，胱氨酸和谷氨酸水平不會明顯變化。此外，與葉酸生物合成相關的關鍵代謝產物水平降低，包括葉酸和 5-甲基四氫葉酸。

GSH 合成成分水平變化

 由此可見，GSH 的耗竭和一些直接、間接的靶向機制，都可以導致 GPX4 失活，而且除抑制體系 System Xc-外，直接抑制 GSH 的合成也可誘導鐵細胞凋亡。因此可通過調控 PSTK 維持 GPX4 的活性和 GSH 的合成來保護 HCC 細胞免受鐵細胞死亡的誘導。

      PSTK 抑制劑   

作者利用 TargetMol 的化合物庫進行了基于結構的虛擬篩選以識別 PSTK 抑制劑。top 10 的化合物對接得分如圖所示。通過結合模式分析，選取了 4 個具有代表性的化合物，其中兩種可水解的單寧 (Punicalin 和 Geraniin) 對 PSTK 活性袋的結合親和力最高。

虛擬篩選后top 10 的化合物
 

這兩種單寧直接用于治療 HCC 細胞時，會使得 HCC 細胞對索拉非尼更加敏感，且腫瘤細胞中 GPX4 蛋白水平會顯著降低。

CCK-8 試驗表明，Geraniin 和 Punicalin 具有顯著的抗 HCC 活性

PSTK 和 GPX4 蛋白水平顯著降低

同時，在一項動物研究中發現 Punicalin/ geraniin 與 Sorafenib 一起口服后，Punicalin 與 Sorafenib 協同作用能夠顯著抑制腫瘤生長。

動物實驗中腫瘤體積隨時間變化

因此，使用 Punicalin 阻斷 PSTK 激酶活性可能是克服肝癌中索拉非尼耐藥的一種有效手段。 綜上所述，作者的研究確定了 PSTK 是肝癌細胞鐵死亡抵抗的關鍵介質。從機制上講，PSTK 的耗竭與硒代半胱氨酸依賴的 Gpx4 激活、谷胱甘肽代謝和葉酸合成的抑制有關，并可導致亞致死性鐵死亡的誘導，從而使肝癌細胞對能夠誘導鐵死亡的靶向治療更加敏感。因此，抑制 PSTK 可能是克服肝癌患者靶向治療耐藥性的一種新穎可行的方法，該蛋白的抑制劑值得進一步的臨床研究。  陶術可提供多種 PSTK 抑制劑相關的化合物和化合物庫以及虛擬篩選服務，助力領域相關研究。

References

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