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如何選擇正確的反轉錄方法

來源:上海滬震生物科技有限公司   2022年03月09日 14:43  

逆轉錄PCR(RT-PCR)在實驗室中經常被用于檢測和量化樣本中的RNA表達。實驗的第一步是通過逆轉錄(RT)將不穩定的RNA轉化為互補的DNA(cDNA)。實際上,RT是許多用于研究RNA的分子生物學技術的第一步,因為將不穩定的RNA轉換為更穩定的DNA會使分析更容易、更可靠。對于RT-PCR,有一步法和兩步法。

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在一步法RT-PCR中,RT反應和PCR擴增是在同一管中進行。將RNA模板添加到試管中,加有兩種酶(逆轉錄酶和DNA聚合酶),以及完成反應的所有必須組分。逆轉錄酶產生cDNA產物,然后逆轉錄酶和cDNA變性,DNA聚合酶擴增cDNA。在一步法中,RT反應由基因特異性引物啟動。因此,只有感興趣的區域被反向轉錄,然后進行擴增。

在兩步法RT-qPCR中,RT反應與PCR擴增單獨進行。首先,RNA添加到反應混合物中,混合物包括逆轉錄酶和oligo-dTs (結合mRNA的poly-A尾巴)或隨機六聚體(或兩者都有),合成cDNA。下一步,從管子中取出少量cDNA,置于一個新管中,作為PCR的模板與基因特定的引物一起混合。因為RT反應采用隨機啟動或由oligo-dTs進行啟動,總RNA或總mRNA在RT步驟中被轉錄。

盡管這兩種方法都能得到最終的結果,但是每種方法都有優缺點。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結它們的優缺點。

一步法RT-PCR 


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一步法原理


原理 :   One step RT-PCR采用了一步反應法完成整個RT-PCR反應,即RNA-cDNA-qPCR反應操作在同一反應體系中進行,反應過程中不需增加額外的步驟,就可完成整個RT-PCR反應,具有方便、簡捷、靈敏度高、重復性好的特點,可適用于各種動物、植物、病毒RNA的qPCR檢測。

優點 : 

1.簡便操作 

2.減少污染的可能性。(RT和qPCR反應之間無需開管)。

3.另外由于得到的全部cDNA產物都一起經PCR擴增,使得一步法的靈敏度更高。

4.適用于定量PCR。

缺點 :靈敏度要比兩步法低。不適合PCR初期條件的摸索,出了問題之后不能夠很好的找到原因

兩步法RT-PCR

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兩步法原理

原理 :   與一步法RT-PCR相比,兩步法RT-PCR的缺點包括多個步驟延長了工作流程、增加樣本處理和操作步驟以及提高污染和結果變異的可能性。但是兩步法可以獲取大量的cDNA,同時可檢測單個RNA樣本中多個基因。

優點 : 靈敏度要比一步法高。在初期摸索PCR條件時,可以很容易找到問題所在。還有更為關鍵的一點是,做兩步法可以節約monney,特別是寶貴的反轉錄酶,把反轉錄體系分開做,一次的轉錄產物可以多次用來做PCR,非常適用于摸索PCR條件。

缺點:它更耗費時間,且帶來污染的可能性更高。RT步驟轉錄所有的RNA以相同的效率,選擇這種方法時,應該考慮到啟動會影響qPCR的結果。如果你在PCR初期建議用一步法。如果你的條件摸索成熟建議用兩步法

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