在兩步法RT-qPCR中，RT反應與PCR擴增單獨進行。首先，RNA添加到反應混合物中，混合物包括逆轉錄酶和oligo-dTs (結合mRNA的poly-A尾巴)或隨機六聚體(或兩者都有)，合成cDNA。下一步，從管子中取出少量cDNA，置于一個新管中，作為PCR的模板與基因特定的引物一起混合。因為RT反應采用隨機啟動或由oligo-dTs進行啟動，總RNA或總mRNA在RT步驟中被轉錄。

盡管這兩種方法都能得到最終的結果，但是每種方法都有優缺點。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結它們的優缺點。

一步法RT-PCR 

一步法原理

原理 :   One step RT-PCR采用了一步反應法完成整個RT-PCR反應，即RNA-cDNA-qPCR反應操作在同一反應體系中進行，反應過程中不需增加額外的步驟，就可完成整個RT-PCR反應，具有方便、簡捷、靈敏度高、重復性好的特點，可適用于各種動物、植物、病毒RNA的qPCR檢測。

優點 : 

1.簡便操作 

2.減少污染的可能性。（RT和qPCR反應之間無需開管）。

3.另外由于得到的全部cDNA產物都一起經PCR擴增，使得一步法的靈敏度更高。

4.適用于定量PCR。

缺點 :靈敏度要比兩步法低。不適合PCR初期條件的摸索，出了問題之后不能夠很好的找到原因

兩步法RT-PCR

兩步法原理

原理 :   與一步法RT-PCR相比，兩步法RT-PCR的缺點包括多個步驟延長了工作流程、增加樣本處理和操作步驟以及提高污染和結果變異的可能性。但是兩步法可以獲取大量的cDNA，同時可檢測單個RNA樣本中多個基因。

優點 : 靈敏度要比一步法高。在初期摸索PCR條件時，可以很容易找到問題所在。還有更為關鍵的一點是，做兩步法可以節約monney,特別是寶貴的反轉錄酶，把反轉錄體系分開做，一次的轉錄產物可以多次用來做PCR，非常適用于摸索PCR條件。

缺點：它更耗費時間，且帶來污染的可能性更高。RT步驟轉錄所有的RNA以相同的效率，選擇這種方法時，應該考慮到啟動會影響qPCR的結果。如果你在PCR初期建議用一步法。如果你的條件摸索成熟建議用兩步法