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Cytoskeleton 艾美捷 Vav2蛋白實驗原理

來源:武漢艾美捷科技有限公司   2022年03月08日 16:18  

人類Vav2蛋白的DH結構域已在細菌表達系統中產生。它含有一個6xHis標記在其氨基末端用于純化。注冊號為NM001134398.1GE06的分子量約為25kDaVav2 DH蛋白以白色凍干粉末的形式提供。蛋白質純度通過在4-20%聚丙烯酰胺梯度凝膠上掃描考馬斯藍染色蛋白質的密度測定來確定。Vav2 DH蛋白的純度約為80%

 

Cytoskeleton/艾美捷Vav2蛋白是一種對Rac1有選擇性的鳥嘌呤交換因子,在多種條件下介導Rac1激活,并與胃腫瘤以及細胞體積控制和神經軸突延伸有關

1.Vav2 GTP/GDP交換活性抑制劑的研究

2.Vav2 DH結構域結合蛋白的鑒定

3.不同GTP酶對Vav2-GEF活性的研究

 

Cytoskeleton 覆蓋肌動蛋白,微管蛋白,馬達蛋白,小G蛋白,細胞外基質,活細胞成像等相關領域,提供對應的蛋白質,抗體,檢測與分析試劑盒

 

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Cytoskeleton/艾美捷Vav2蛋白生物活性測定:

Vav2 DH的生物活性可以通過其催化Rac1上核苷酸交換的能力來確定,使用Bodipy GDP的核苷酸交換試驗檢測過量的GDPGTPRac1蛋白質通過添加過量的EDTA預加載Bodipy FL GDP,例如,反應中每mmol Mg2+離子添加0.7 mmol EDTA。然后以解離分析的形式使用該子儲備溶液,這表明與未標記的核苷酸競爭交換位點。反應通過485nm Ex/535nm Em下的熒光測量進行監測。嚴格的質量控制確保在存在0.8µM Vav2 DH的情況下,Bodipy GTPmant GTP的交換率至少提高五倍。

 

方法:

1.將Vav2小瓶放在冰上,用冰冷交換緩沖液稀釋至0.30微克/微升(8微升)。

2.用冰冷交換緩沖液將Rac蛋白稀釋至1.25µg/µl50µM)。

3.在新鮮的15毫升Falcon管中加入以下成分,并通過移液管或輕輕旋渦充分混合:

每口井的成分微升交換緩沖區75

50µM?Rac 5

8µM Vav2 10

注:對于總混合物體積,將每個孔的試劑體積乘以實驗中的孔數,再加上20%的體積以計算移液損失。

4.在室溫(RT)下培養20分鐘。

5.通過添加10µl(每孔)50 mM MgCl2鎖定核苷酸。

6.設置熒光計,激發波長為485 nm+/-15 nm,發射波長為525 nm+/-15 nm

7.將預加載的混合物等分到指丨定的孔中,并將平板放入熒光計中。

8.在5個周期(150秒)后,將程序置于保持或暫停狀態,然后卸下平板。

9.移取10µl a5 mM GTP溶液,b)小化合物,c)測試蛋白質,d4 mM EDTA+ve交換對照)或e)稀釋緩沖液(陰性對照)于各孔中,并立即上下移液兩次,然后繼續讀取20分鐘。

10.完成動力學方案后保存讀數。通過將數據減少到最大斜率(使用12個點)或Vmax,并使用讀板器附帶的軟件,可以計算匯率。交換曲線可以通過導出到Microsoft Excel來實現。

 

艾美捷科技是Cytoskeleton的中國代理商,為科研工作者提供優質的產品與服務。


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