MB10082.1 v.A

  細菌DNA損傷彗星熒光檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

  細菌DNA損傷彗星（Comet）熒光檢測試劑是一種旨在采用細菌細胞中性凝膠電泳，在電場環境下，損傷變性的DNA*段遷移形成特定的形態，即DNA移動尾巴，來進行體外評價和半定量分析DNA損傷程度的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于新鮮細菌細胞的DNA損傷研究，包括DNA鏈斷裂、氧化性堿基損傷、DNA剪切損傷、DNA交聯、DNA修復等，應用于環境和藥物毒理學、放射學、氧化應急反應、抗生素敏感性等研究。產品嚴格無菌，即到即用，性能穩定，操作簡便，重復一致。

技術背景

彗星檢測技術（Comet assay），又稱為單細胞凝膠電泳檢測技術（single cell gel electrophoresis assay；SCGE）或微凝膠電泳檢測技術（microgel electrophoresis assay），是基于變性切離的DNA*段，在電場的影響下，從細胞中移出的原理，而完整的超螺旋DNA仍然保持在細胞核內。通過凝膠電泳，呈現出分子遷移圖形，形成彗星拖尾（comet tail）現象，即完整DNA的細胞染色體為“頭”，而松散和斷裂的DNA為“尾”，以此評價DNA損傷程度。這是分析單一細胞DNA鏈斷裂的敏感方法之一。其技術方法的基本步驟是：第一，細胞固定包埋在凝膠里；第二，細胞裂解處理；第三，DNA變性處理；第四，電泳遷移；第五，染色和圖像分析。由此觀察DNA遷移形態，進行體外檢測，成為細胞DNA損傷研究的基本手段。

產品內容

  膠體液（Reagent A）             毫升

  基質液（Reagent B）             毫升

  酶解液（Reagent C）             微升

  裂解液（Reagent D）             毫升

  解構液（Reagent E）             毫升

  電泳液（Reagent F）             用戶自備

  中和液（Reagent G）                 用戶自備

  染色液（Reagent H）          毫升

產品說明書             1份

保存方式

保存  酶解液（Reagent C）和  染色液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免光照；  膠體液（Reagent A）和  基質液（Reagent B）室溫下保存；其余的保存在4℃冰箱里；  解構液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

無離子水：用于稀釋電泳緩沖液

  電泳液（Reagent F）：用于電泳的緩沖液（配方見注意事項8）

  中和液（Reagent G）：用于電泳后凝膠清洗（配方見注意事項9）

磨砂載玻片和蓋玻片：用于放置樣品進行微凝膠電泳的器材

恒溫培養箱：用于孵育反應

電泳槽：用于微凝膠電泳的裝置

1.5毫升離心管：用于混勻基質液的容器

90 mm細菌培養皿：用于樣品處理、染色等的容器

熒光顯微鏡：用于觀察細胞彗星現象

實驗步驟

一、 瓊脂載玻片準備

1． 準備1張*磨砂載玻片，磨砂面朝上

2． 將  膠體液（Reagent A）置于微波爐里加熱溶化（注意：避免溢出或干枯；參見注意事項4）  

3． 放進45℃恒溫水槽孵育10分鐘

4． 移出xx微升  膠體液（Reagent A）到載玻片中間

5． 蓋上潔凈的蓋玻片

6． 輕壓蓋玻片5分鐘，確保膠體液鋪展

7． 放進4℃冰箱里直至膠體充分凝結

二、 細胞準備

實驗開始前，將  基質液（Reagent B）置于微波爐里加熱溶化（注意：參見注意事項4），然后放進45℃恒溫水槽備用。然后進行下列操作。

1． 準備1管待測的新鮮培養細菌細胞 （2 X 10⁶細菌/毫升）

2． 移出20微升菌液到1.5毫升離心管

3． 加入xx微升在45℃恒溫水槽里的  基質液（Reagent B）

4． 用槍頭上下抽吸混勻

5． 用大拇指推動移走上述制備的載玻片上的蓋玻片

6． 即刻移取75微升細菌基質混合液到載玻片膠體上

7． 用新的蓋玻片蓋上

8． 輕壓蓋玻片5分鐘，確保細菌基質混合液鋪展

9． 放進4℃冰箱里冷卻10分鐘，直至膠體凝結，避免光照

10． 移出20微升室溫預熱的  酶解液（Reagent C）到1.5毫升離心管

11． 加入xx微升在45℃恒溫水槽里的  基質液（Reagent B）

12． 用槍頭上下抽吸混勻

13． 用大拇指推動移走上述制備的載玻片上的蓋玻片

14． 即刻移取200微升酶解基質混合液到載玻片樣品上面

15． 用新的蓋玻片蓋上

16． 輕壓蓋玻片5分鐘，確保酶解基質混合液鋪展

17． 在37℃溫度下孵育30分鐘，避免光照（注意：同時確保膠體凝結）

18． 再次用大拇指推動移走蓋玻片

19． 將載玻片放進9cm細菌培養皿

20． 加入xx毫升4℃預冷的  裂解液（Reagent D）

21． 放進4℃冰箱里孵育60分鐘

22． 抽去裂解液

23． 加入xx毫升  解構液（Reagent E）

24． 室溫下孵育30分鐘，避免光照

25． 小心抽去解構液

三、 凝膠電泳

1． 移出xx毫升用戶自備的  電泳液（Reagent F）到250毫升三角燒瓶里

2． 加入225毫升用戶自備的無離子水，充分混勻后，標記為  電泳工作液

3． 加入xx毫升  電泳工作液到上述9cm細菌培養皿

4． 室溫下孵育5分鐘

5． 倒去電泳工作液

6． 重復實驗步驟3至5一次

7． 將載玻片置于（具有溫度控制的）水平電泳槽里

8． 加入適量的  電泳工作液到電泳槽里，恰好在載玻片之上

9． 插上電源，設定電壓為12伏或電壓1.5伏/厘米（根據電泳槽正負電極的距離）

10． 在4℃環境下，電泳30分鐘（注意：可以延長時間，最大限度顯示拖尾現象）

11． 斷開電源，取出載玻片

12． 放進9cm細菌培養皿

13． 加入xx毫升用戶自備的  中和液（Reagent G）

14． 在4℃冰箱里孵育5分鐘

15． 倒去中和液

16． 空氣中晾干

四、 染色分析

1． 加上xx微升  染色液（Reagent H）

2． 蓋上新的蓋玻片

3． 室溫下孵育15分鐘，避免光照

4． 即刻在熒光顯微鏡油鏡下觀察并拍照記錄：激發波長480nm；散發波長610nm或紫外波長激發

5． 室溫下避光保存，如果重新觀察，可以重復實驗步驟1至4

6． 分析參數：

1） 形態指標，即拖尾率目測計量（comet％）。根據熒光圖像是否象彗星一樣頭尾分明將其分為彗星樣細胞和非彗星樣細胞，計數一定量細胞中彗星樣細胞所占的比例，即彗星樣細胞發生率（comet％），估計 DNA 的損傷程度。通過鏡下觀察，計數500個細胞，直接得到，方便實用。

2） 距離指標，即直接在顯微鏡下或在照片上測出彗星的一些長度數值。

（1） 尾長（Tail Length；µm）：沿電泳方向尾部最遠端與頭部中心間的距離（遷移距離）――距離越長，DNA損傷越嚴重

（2） 總彗星長度（comet length；µm）：從頭至尾，電泳方向上的最大長度――長度越大，DNA損傷越嚴重

（3） 尾長與頭部直徑比值：沿電泳方向尾部最遠端與頭部中心間的距離與頭部直徑之比――比值越大，DNA損傷越嚴重

3） 強度指標，即DNA含量

（1） 頭部和尾部熒光百分比：尾部總熒光強度與頭部總熒光強度的比值――百分比越高，DNA損傷越嚴重

（2） 尾部和總彗星熒光百分比（Tail DNA％）： 檢測500個細胞

4） 矩類指標，構建距離、強度的平均關系數值

（1） 尾矩（tail moment；TM），又稱為Olive tail moment（OTM）：尾部 DNA 占總 DNA 的百分比與頭、尾部中心間距的乘積，單位為µm%或µm tail fraction

（2） 彗星矩（comet moment；CM）：以頭部中心點為零點，沿電泳方向將彗星按一定的間隔分成若干個區域（80個），分別測定每個區域的熒光強度乘以該區域中心距零點的距離除以彗星總熒光強度

7. 構建DNA損傷程度和藥物處理劑量（dose）或時間（time）曲線

注意事項

1． 本產品為20次操作

2． 操作時須戴手套

3． 整個操作，建議在暗光下進行

4．   膠體液（Reagent A）和  基質液（Reagent B）微波爐加熱融化時，松開瓶蓋，低功率，且密切觀察，防止過度加熱，導致溢出或干枯

5． 建議使用新鮮培養的細菌細胞

6． 如果細菌的鞭毛功能較強，或細胞壁難以裂解，建議使用  細菌細胞彗星實驗預處理試劑盒－GMS10082.3

7． 可以使用100微摩爾/升過氧化氫或25微摩爾/升高錳酸鉀冰上孵育10分鐘預處理樣品作為陽性對照

8． 操作時小心輕柔，避免膠體脫位

9． 電泳溫度過高，會造成膠體脫位

10．   電泳液（Reagent F）：10倍TBE

11．   中和液（Reagent G）：70％乙醇

12． 電泳時，根據用戶所使用的電泳槽的電極兩端實際距離，按照1.5伏/厘米確定電壓強度

13． 細菌DNA損傷彗星圖像如下

14． 由于細菌染色體只有1條，閉環DNA鏈，3000左右kb，彗星尾巴形態常為線條狀或彌散狀

15． 本公司提供系列DNA損傷檢測分析試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定重復性好