蛋白定量的方法有很多種,應用較多的主要有兩種:BCA蛋白定量檢測法和Bradford蛋白定量檢測法,市售的蛋白定量試劑盒也多基于上述兩種檢測方法而開發的。兩種方法均需配制蛋白標準品,蛋白與定量試劑經過一定時間的反應(BCA法反應為37℃、20-30min,Bradford法反應一般為37℃,5min),酶標儀讀取樣品的OD值,繪制的蛋白標準曲線,依據標準曲線計算WB蛋白的濃度。兩種檢測方法筆者均有使用經驗,相比BCA法,Bradford法不僅節省反應時間,也無需配置反應試劑,簡單、快速、好用,筆者推薦Bradford法測定蛋白濃度。
嚴格來說,每次的蛋白濃度測定均需配制新鮮蛋白標準品,保證每次測到的蛋白濃度的準確性。然而,WB法評估蛋白表達水平本身就是一種半定量或者相對定量,因此在實際蛋白樣本準本及濃度測定時只需保證均一性即可,即使用同樣的標準曲線計算同一批蛋白的濃度,如果計算準備即可保證蛋白上樣時內參水平基本一致。因此,在實際操作中我們只需測定一次標準品的OD值、繪制標準曲線,即可用此曲線來計算后續實驗蛋白的濃度,節省時間和試劑。
具體的蛋白定量步驟,各位朋友參考試劑盒提供的方法即可,簡單易行。至于標準曲線的繪制,網絡亦可查到不是帖子介紹用不同軟件繪制標準曲線。
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