成人做爰免费视频免费看_成人a级高清视频在线观看,成人a大片在线观看,成人a大片高清在线观看,成人av在线播放,一a一级片,一级黄 中国色 片,一级黄 色蝶 片,一级黄色 片生活片

產(chǎn)品推薦:氣相|液相|光譜|質(zhì)譜|電化學(xué)|元素分析|水分測(cè)定儀|樣品前處理|試驗(yàn)機(jī)|培養(yǎng)箱


化工儀器網(wǎng)>技術(shù)中心>解決方案>正文

歡迎聯(lián)系我

有什么可以幫您? 在線咨詢

SDS-PAGE電泳的常見問題解析

來源:檢碩科學(xué)器材(上海)有限公司   2021年11月19日 21:06  

                                                     SDS-PAGE電泳的常見問題解析

                                                     檢碩科學(xué)器材(上海)有限公司

1.關(guān)于凝膠的一些問題

膠的凝結(jié)不好,例如有花紋特別是濃度高的膠在冬天溫度較低的情況下,在分離膠的下部有波浪樣的花紋,凝膠不均勻。解決方法:加大TEMED和過硫酸胺的量,使其凝結(jié)速度加快。同時(shí)洗干凈玻璃板,防止有殘留的膠干結(jié)在玻璃板上。

膠不凝,解決方法:溫度較低時(shí)加大TEMED和過硫酸胺的量,過硫酸胺必須新鮮配制。如若還是不行重新配制一下緩沖溶液。

膠易碎,例如濃度較高的膠在染色和脫色過程以及掃描過程中破裂。解決方法:首先在上述過程中一定要?jiǎng)幼鬏p緩,其次在室溫較高的情況下可以適當(dāng)減少TEMED和過硫酸胺的量。

電泳完后膠上有很多長條紋的雜帶,解決方法:建議電泳緩沖液不要回收利用。配制膠的溶液一定要純。

2.凝膠時(shí)間不對(duì)

通常膠在30分鐘到1小時(shí)內(nèi)凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,AP劑量不夠。如果凝的太快,可能是AP和TEMED用量過多,此時(shí)膠太硬易裂,電泳時(shí)易燒膠。

3.濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對(duì)電泳的影響

前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致;后者是由于在解除制膠的夾子后,板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的,一般對(duì)電泳結(jié)果不會(huì)有太大的影響。

4.樣品的處理

根據(jù)樣品分離目的不同,主要有三種處理方法:還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。

還原SDS處理:在上樣buffer中加入SDS和DTT(或Beta巰基乙醇)后,形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子。

帶有烷基化作用的還原SDS處理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的保護(hù)SH基團(tuán),得到較窄的譜帶;另碘乙酸胺可捕集過量的DTT,而防止紋理現(xiàn)象的產(chǎn)生。100uL樣品緩沖液中加入10uL20%的碘乙酸胺,并在25℃下保藏30min。

非還原SDS處理:生理體液、血清、尿素等樣品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加還原劑,因而蛋白折疊未被破壞,不可作為測(cè)定分子量來使用。

5.條帶兩邊翹起中間凹下的原因(︶)

在較厚的凝膠中,由于凝膠不均勻冷卻,中間部分凝固不好。

電泳系統(tǒng)溫度偏高。

處理辦法:待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6.條帶兩邊向下中間鼓起的原因(︵)

一般原因是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈,或聚合不*。

處理辦法:可在兩板間加入適量緩沖液,以排除氣泡。

7.條帶偏斜

原因:電極不平衡或者加樣位置偏斜。

8.條帶兩邊擴(kuò)散

原因:加樣量過多。

9.電泳的條帶過粗

電泳中條帶很粗是常見的事,主要是濃縮膠的原因。

處理辦法:適當(dāng)增加濃縮膠的長度;保證濃縮膠貯液的pH正確;適當(dāng)降低電壓。

10.目的蛋白質(zhì)條帶模糊

電泳凝膠濃度選擇不當(dāng)。

低于10Kd的小分子蛋白質(zhì)要用Tricine膠。

靠近前沿的電泳帶分辨率不佳。根據(jù)分子量與凝膠孔徑的關(guān)系,選擇適當(dāng)濃度的凝膠。

蛋白質(zhì)樣品水解。注意除去蛋白質(zhì)樣品的內(nèi)源性的水解酶,不要反復(fù)凍融。

電泳時(shí)間過長或過短。溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠的底部即應(yīng)該關(guān)閉電泳電源。

緩沖溶液、SDS都要新鮮配制。

避免加樣過多,提高分辨率。小體積樣品可給出窄帶,加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15uL(即2-10ug蛋白質(zhì))。

加熱變性后的蛋白質(zhì)樣品要放置到室溫即電泳,不要久放,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的二硫鍵在高溫下可能是會(huì)斷開,但是暴露于空氣中溫度降低會(huì)重新形成二硫鍵,而且可能在過久放置過程中蛋白質(zhì)可能會(huì)再折疊,更不要扔到冰箱里保存。

11.“鬼帶”的出現(xiàn)及處理

“鬼帶”就是在跑構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)大分子時(shí),在泳道頂端出現(xiàn)一些未知條帶或在加樣孔底部生成沉淀,這主要是因?yàn)檫€原劑在加熱的過程中被氧化失活,使解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊和亞基重新締合,由于其分子量通常要比目標(biāo)條帶大,所以會(huì)生成未知條帶或沉淀。

處理辦法:在加熱煮沸后,再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇,以補(bǔ)充不足的還原劑;或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。

12.拖尾現(xiàn)象

主要是樣品溶解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。

處理辦法:加樣前離心;選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液,加適量樣品促溶劑;電泳緩沖液時(shí)間過長,重新配制;降低凝膠濃度。

13.紋理現(xiàn)象

主要是樣品不溶性顆粒引起的。

處理辦法:加樣前離心;加適量樣品促溶劑。

14.溴酚藍(lán)不能起到指示作用

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)溴酚藍(lán)已跑出板底,但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。

主要原因:緩沖液和分離膠的濃度過高。

處理辦法:更換正確pH值的Buffer;降低分離膠的濃度。

15.甘氨酸在電極緩沖液中的作用

SDS-PAGE中樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液,電極液選TRIS/甘氨酸,電泳開始后,HCL解離成氯離子,甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,因此一起向正極移動(dòng),其中氯離子最快,甘氨酸根離子最慢,蛋白居中。電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大,超過蛋白,因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū),而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比,因而產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度,使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng),形成以穩(wěn)定的界面,使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近,濃縮成一中間層。

16.電泳電壓很高但電流很低

現(xiàn)象:電壓50v以上,可電流卻在5mA以下。

主要原因:電泳槽沒有正確裝配,電流未形成通路。包括:內(nèi)外槽裝反;外槽液過少等。

處理辦法:正確裝配電泳槽即可。

17.如何提高SDS-PAGE電泳分辨率

使聚丙烯酰胺的充分聚合,可以提高凝膠的分辨率。

建議做法:待凝膠在室溫凝固后,可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或冰箱放置,前者易導(dǎo)致凝固不充分,后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。

18.電泳時(shí)間比正常要長

可能是因?yàn)槟z緩沖系統(tǒng)和電級(jí)緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯(cuò)誤,即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小,或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高。

19.配膠緩沖液系統(tǒng)在電泳中的影響

緩沖液在電泳過程中的主要作用是維持合適的pH。電泳時(shí)正極與負(fù)極都會(huì)發(fā)生電解反應(yīng),正極發(fā)生的是氧化反應(yīng),負(fù)極發(fā)生的是還原反應(yīng),長時(shí)間的電泳將使正極變酸,負(fù)極變堿。緩沖液可以維持溶液兩極的pH保持基本不變。在濃縮膠中,pH環(huán)境呈弱酸性,因此甘氨酸解離很少,泳動(dòng)效率低;而CL離子卻很高,兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶,蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)并聚集到一起,濃縮為一狹窄的區(qū)帶。所以,pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的,實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況,應(yīng)首要考慮該因素。

                                                                                                                                      本篇轉(zhuǎn)載至實(shí)驗(yàn)之家

免責(zé)聲明

  • 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
  • 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí),必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
  • 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
企業(yè)未開通此功能
詳詢客服 : 0571-87858618
主站蜘蛛池模板: 国产亚洲欧美精品一区二区| 欧美久久久久久久久久久| 欧美专区精品国产一区电影| 久久久久久久久久久久高潮| 亚洲欧美综合久久久久久| 琪琪午夜福利免费院| 亚洲欧美中文日韩在线| 韩国电影年轻的妈妈3| 美女免费A片WWW裸身| 在线观看日本黄色网址| 亚洲男人天堂2023| 99久久精品国产亚洲a| 欧美日韩性生活片| NP玩弄纯肉强迫NTR文BL| 精品久久久爽爽久久久AV| 被少妇滋润了一夜爽爽爽小说| 肉欲公交车系列500| 国产网红亚洲欧美精品| 日韩精品一区二区三区色欲AV| 久久精品国产亚洲av第一| 日韩欧美aⅴ综合网站发布| 手机看片日本| 中文字幕日韩精品这里只有| 久久国产一区二区三区| 免费A片看黄网站WWW下载| 毛片av永久在线观看| 国产精品日韩福利| 国产 欧美 日韩在线| 精品久久 亚洲| 精品国产乱码久久久久久青草| 国内精品久久久久影院老司| 国产精品手机网站| 少妇性BBB搡BBB爽爽爽欧美| 亚洲人成电影网站在线观看| 国产精人妻无码一区麻豆| 国产深夜福利在线观看网站| 国产少又黄又爽的A片| 国产伦精品一区二区免费| 国产精品密蕾丝视频| 神电影院午夜dy888我不卡| 日韩中文字幕在线观看.|