主要用途 

    純化細(xì)胞色素C氧化酶活性測(cè)定試劑是一種旨在通過(guò)細(xì)胞色素C氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中還原性細(xì)胞色素C氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法測(cè)定樣品中酶活性的經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于來(lái)自各種細(xì)胞或組織（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲(chóng)等）的*或部分純化的細(xì)胞色素C氧化酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

    細(xì)胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase）存在于真核生物的細(xì)胞線粒體上，主要通過(guò)氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量。基于底物還原型細(xì)胞色素C（reduced cytochrome c），受到細(xì)胞色素C氧化酶的催化，轉(zhuǎn)化為氧化型細(xì)胞色素C（oxidized cytochrome c），在分光光度儀下，出現(xiàn)吸光值的變化（550nm 波長(zhǎng)），由此定量測(cè)定細(xì)胞色素C氧化酶的活性。細(xì)胞色素C氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A）         毫升

反應(yīng)液（Reagent B）         毫升

稀釋液（Reagent C）           毫升

穩(wěn)定液（Reagent D）           微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)               1份

保存方式

緩沖液（Reagent A）和稀釋液（Reagent C）保存在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent B）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)液配制的容器

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent B）置入冰槽里融化，然后移出100微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升穩(wěn)定液（Reagent D），輕柔混勻后，室溫下避光靜置至少15分鐘（可見(jiàn)顏色變化），置于冰槽里，標(biāo)記為反應(yīng)工作液（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)4），放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。

一、 測(cè)讀準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好純化的細(xì)胞色素C氧化酶的蛋白樣品，置于冰槽里融化 

2． 設(shè)定好分光光度儀：溫度25℃，波長(zhǎng)550nm，間隔10秒，測(cè)讀7次（共60秒），并置零或設(shè)置0秒和60秒各測(cè)讀1次

二、 背景對(duì)照測(cè)定 

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的1毫升比色皿

2． 加入xx微升稀釋液（Reagent C）

3． 上下傾倒數(shù)次，混勻

4． 室溫下孵育2分鐘

5． 放進(jìn)分光光度儀，置零

6． 取出比色皿，加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent B）和穩(wěn)定液（Reagent D）的反應(yīng)工作液

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（0秒讀數(shù)－60秒讀數(shù)），

三、 樣品測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入100微升待測(cè)樣品（注意：建議總量2微克酶蛋白，且樣品需澄清）

3． 上下傾倒數(shù)次，混勻

4． 室溫下孵育2分鐘

5． 放進(jìn)分光光度儀，置零

6． 取出比色皿，加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent B）和穩(wěn)定液（Reagent D）的反應(yīng)工作液

7． 即刻上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（0秒讀數(shù)－60秒讀數(shù)）

四、 計(jì)算樣品活性 

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 樣品制備中忌用DTT和巰基乙醇等處理

4． 每增加1個(gè)樣品，增加反應(yīng)工作液為：反應(yīng)液（Reagent B）50微升＋穩(wěn)定液（Reagent D）1.5微升，以此類推。配制反應(yīng)工作液時(shí)，須根據(jù)樣本數(shù)量配制實(shí)際工作液容量。

5． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次

6． 分光光度計(jì)波長(zhǎng)嚴(yán)格設(shè)置在550nm，誤差10nm將不產(chǎn)生信號(hào)

7． 加樣后3秒內(nèi)進(jìn)行比色測(cè)定

8． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*

9． 背景空對(duì)照0秒讀數(shù)通常0.2至0.8為理想狀態(tài)

10． 背景空對(duì)照的正常讀數(shù)差值（0秒－60秒）通常為0.001至0.005（正負(fù)即可）

11． 樣品0秒讀數(shù)通常和背景空對(duì)照0秒讀數(shù)一致

12． 樣本測(cè)定60秒讀數(shù)低于0秒讀數(shù)表明具有酶活性

13． 酶活性單位濃度定義：在25℃室溫下，pH 7.0的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）氧化1微摩爾的細(xì)胞色素C

14． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為2微克/100微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，即60秒讀數(shù)不變或?yàn)榱悖瑒t可以增加或降低樣本量（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

15． 本公司提供系列細(xì)胞色素相關(guān)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感