實(shí)驗(yàn)試劑

1. Ficoll(Amersham Biosciences)

2. 冰冷磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH 7.4

3. 裂解緩沖液：5mol/L單巰基氰酸胍，10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，50mmol/L Tris—HCl，1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，用0.45微孔濾膜過濾

4. 4mol/L和3mol/L氯化鋰，高壓滅菌

5. RNA溶解緩沖液：0．1%SDS，lmmol/L EDTA，10mmol/LTris—HCl，pH 7．5，高壓滅菌

6. 3mol/L乙酸鈉，pH 4．8，焦碳酸二乙酯  (DEPC)  處理  (加0．2ml DEPC/100ml溶液)并滅菌

7. DEPC處理過的水  (0．2ml DEPC/100ml水)，高壓滅菌

8. 用Tris平衡的酚(Sigma)

9. 氯仿；異戊醇(24：1)(Sigma)

10. 100%乙醇，-20℃

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1. 30m1Corex管，酸洗并硅化

2. 預(yù)冷離心機(jī)和吊桶式轉(zhuǎn)頭

實(shí)驗(yàn)步驟

1．收集新鮮人血液并立即用Ficoll分離白細(xì)胞。

2．用冰冷PBS洗滌外周血淋巴細(xì)胞3次。

3．在50ml塑料離心管中收集外周血淋巴細(xì)胞，并加入7ml裂解緩沖液(可溶解達(dá)到5×10⁸ 個(gè)外周血淋巴細(xì)胞)，然后劇烈渦旋振蕩以溶解細(xì)胞。

4．加入7體積(49m1)4mol/L氯化鋰，4℃孵育15～20小時(shí)(過夜)。

5．將懸液轉(zhuǎn)移到30mlCorex管內(nèi)，在吊桶式轉(zhuǎn)頭內(nèi)4℃離心2小時(shí)，6500r/min。

6．棄去上清，并用Kimwipe擦拭試管口。用3mol/L氯化鋰(大約15ml)重懸，收集沉淀.將沉淀重懸液離心，6500r/min 1小時(shí)。

7．棄去上清，用2m1RNA溶解液溶解沉淀。在-20℃下，*冷凍懸液。  

8．復(fù)溶懸液，每10分鐘渦旋20秒，共45分鐘。

9．用等體積酚抽提1次，并用等體積氯仿抽提1次。

10．加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉，pH 4.8和2體積一20℃乙醇。*混合溶液，并在-20℃下孵育過夜。

11．在吊桶式轉(zhuǎn)頭內(nèi)離心RNA，12000r/min 30分鐘。用0.2m1DEPC處理水重懸沉淀。將溶解的DNA轉(zhuǎn)移至1.5m1微量離心管內(nèi)，并加入1/10體積3mol/L乙酸鈉，pH 4.8和2體積-20℃乙醇，重新沉淀。并以乙醇沉淀物形式保存RNA，直至準(zhǔn)備使用時(shí)。