50270.1 v.A

  細胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）活性比色法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

  細胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過三肽化合物底物p-ERG-pNA受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放黃色對硝基苯胺，產生吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體等）尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（urokinase-type Plasminogen Activator；uPA；EC3.4.21.73），又稱為尿激酶（urokinase；UK），屬于絲氨酸蛋白酶，存在于血液、細胞外基質和尿液中。尿激酶由411氨基酸構成，分子量為54KD，有3個結構域：絲氨酸蛋白酶結構域、kringle結構域和生長因子結構域。其主要的生理性底物為纖維蛋白溶酶原（Plasminogen），即纖維蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen），切離部位為Cys-Pro-Gly-Arg⊥Val -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切離后激活，纖維蛋白溶酶參與細胞蛋白水解過程，包括血栓溶解（thrombolysis）和細胞外基質降解等。uPA與組織重構、修復、血管形成（angiogenesis）性疾病和腫瘤擴散有關。uPA的抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpins），即纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑（Plasminogen Activator Inhibitor；PAI）。基于人工合成的三肽化合物底物p-EGR-pNA（pyro-Glu-Gly-Arg-p- Nitroaniline；焦谷氨酸酰甘氨酰精氨酰對硝基苯胺）受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放有色對硝基苯胺，在分光光度儀（405nm 波長）下，測定吸光峰值的變化，來定量測定尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的活性。其反應系統為：

uPA

p-EGR-pNA-HCl       →          p-EGR-OH  +   pNA

                                       （黃色）

產品內容

  清理液（Reagent A）        120毫升

  裂解液（Reagent B）         10毫升

  緩沖液（Reagent C）          2毫升

  陰性液（Reagent D）            1毫升

  底物液（Reagent E）          220微升

產品說明書                1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；  底物液（Reagent E）避免光照和反復凍融；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

微型臺式離心機：用于樣品沉淀

培養箱：用于反應物孵育

96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于樣品比色測定的容器

酶標儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后進行下列操作。

一、 樣品制備

1． 準備好75cm²細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁷細胞）

2． 小心加入3毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入3毫升  清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入200至500微升  裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、 測定準備

1． 準備好上述制備的待測樣品

2． 設定好分光光度儀或酶標儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零

三、 活性測定

1． 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品

2． 分別移取85微升  緩沖液（Reagent C）到相應孔里

3． 分別加入5微升  陰性液（Reagent D）或上述制備的待測樣品（50微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）

4． 分別加入10微升  底物液（Reagent E）

5． 輕輕搖動96孔板（注意：避免氣泡）

6． 在37℃溫度下孵育60分鐘（注意：可見反應孔里呈現肉眼可見的黃色）

7． 即刻放進酶標儀檢測或轉移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測

8． 活性計算：

（1） 酶標儀檢測

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.10（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數）X 60（反應時間；分鐘）X 0.3（光徑距離；厘米）]＝單位/毫升 

轉換：單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

（2） 比色皿檢測

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.10（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數）X 60（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升 

轉換：單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

注意事項

1． 本產品為21次操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需1次

4． 樣品須澄清，且避免反復凍融

5． 測定值由低到高變化；測定可持續60分鐘

6． 比色測定后，比色皿須清洗*

7． 樣本測定60分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性

8． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過低，則可以延長反應孵育時間至16小時；其次增加樣本量（本公司提供    Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）

9． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

10． 尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑單位活性定義為：在37℃，pH 7..5條件下，每分鐘內能夠切離1微摩爾三肽化合物底物p-ERG-pNA所需的酶量作為一個活性單位

11． 本公司提供系列細胞蛋白酶學檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感