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酶切反應條件的優化

來源:安諾倫(北京)生物科技有限公司   2021年09月13日 09:27  

當建立內切酶酶切反應體系時有幾個關鍵因素需要考慮。比如如何在正確的反應體系中,加入適量的DNA、內切酶和緩沖液,就可以獲得最佳酶切效果。根 據定義,在50μl體系中,1單位的限制性內切酶可以在60分鐘內*切割1μg的底物DNA。上述酶、DNA與總反應體積的比值可以做為建立反應體系的 參考數據。但是,目前大多數科研人員會遵循下表中所列的標準反應條件,使用5-10倍的過量酶切割DNA,這樣有利于克服由于DNA來源不同、質量和純度 不同而造成的實驗失敗。

“標準”反應體系

1.jpg

內切酶

從冰箱取出后請一直置于冰上。

酶最后加入到反應體系中。

加入酶之前將反應混合物混勻,可以用移液槍上下吹打或輕彈管壁,然后在離心機中快速離心。切忌振蕩混勻!

當切割超螺旋質粒和瓊脂糖包埋DNA時,通常需要超過1unit/μg的酶量以達到*酶切。

DNA

避免酚、氯仿、酒精、EDTA、變性劑或過多鹽離子的污染。

甲基化的DNA會抑制某些酶的切割效率。

緩沖液

使用終濃度為1X的緩沖液。

根據實驗需要加入終濃度為100μg/ml的BSA(1:100稀釋)。

在不需要BSA即可達到最佳活性的酶切反應中如果加入BSA也不會影響酶切效果。

反應總體積

建議在50μl反應體系中消化1μg底物DNA。

為避免星號活性,甘油濃度應<5%。

加入內切酶(貯存于50%甘油中)的量應不超過總體積的10%。

使用以下技術,內切酶的反應條件可能未達到最佳反應條件:克隆、基因分型、突變檢測、基因定位、探針制備、測序和甲基化檢測等。

內切酶貯存液中的添加物(如:甘油和鹽)和底物溶液中尚存的殘余物(如:鹽、EDTA或乙醇)會導致小體積反應體系出現問題。NEB提供了一系列高保真內切酶(方便建立反應體系。下述為小體積反應體系反應指南。

酶切反應體系的選擇

2.jpg

反應時間

標準一小時。

可加入過量的酶以縮短反應時間,或者使用能夠快速酶切的內切酶。

對于許多酶,都可以用更少單位的酶消化16小時。

終止反應

若消化后的DNA不需要進行后續的實驗操作:

用終止液終止反應【50%甘油、50mMEDTA(pH8.0)和0.05%溴酚藍(NEB#B7021)】。按每50μl反應體系中加入10μl的比例進行。

若消化后的DNA需要進行后續的實驗操作:

用熱失活法。

利用商業化的離心柱或酚/氯仿抽提去除內切酶。

貯存

大多數內切酶建議保存在-20℃。只有少數內切酶若貯存時間超過30天建議保存在-70℃。詳細的貯存信息請參閱內切酶使用說明書或目錄。

10X反應緩沖液和BSA貯存液也應保存在-20℃。

不要將BSA直接加入到10X反應緩沖液中再凍存,因為這樣BSA會產生沉淀。

穩定性

在任何情況下,都應盡可能的避免將酶置于高于-20℃的溫度下。

對照反應

如果在切割底物DNA時遇到了問題,建議加入以下對照實驗:

沒有加入內切酶的實驗DNA,以檢測DNA制備和反應緩沖液中是否存在污染。

加入了內切酶的對照DNA(含有多個已知內切酶切割位點的DNA,如LambdaDNA或腺病毒-2DNA),以檢測內切酶的活性。

如果對照DNA能夠被切割而實驗中的底物DNA不能,可以將這兩種DNA混合在一起再進行酶切,以檢測實驗用的底物DNA中是否存在抑制反應的物質。如果確實存在某種抑制因子(通常為鹽、EDTA或酚),則混合之后對照DNA也不能被切割。

注意:由于某些酶與DNA結合的親和性非常高,所以不能很好地與產物分離。這樣在進行瓊脂糖凝膠電泳時就會出現彌散現象。若出現這種情況,可以在反應結束后加入終濃度為0.1-0.5%的SDS,帶型會更加清晰。

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