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層析柱是凝膠層析技術中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。根據樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數不同，從而分離的一種層析法。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。
層析柱詳細的操作方法：
以中壓柱層析法提取分離冬凌草甲素為例
1、吸附劑的處理及柱子裝填
將一定量薄層層析硅膠裝人搪瓷盤置于烘箱中，于105C活化2H后，取出放置室溫即可裝柱。柱子采用干法填充，填滿整個柱體，不留死體積，密封后用柱塞式計量溶劑泵按丙酮一石油醚(5:95)比例泵人溶劑，至溶劑流出止。
2、上樣
將冬凌草的乙醇提取物400G用適量丙酮溶解，泵人中壓柱柱頭，然后泵人石油醚1000RID。
3、洗脫
以一定比例的石油醚一丙酮為洗脫液，60ML/MIN的流速進行梯度洗脫，柱的使用壓力為2~3KG/C。按每份500ML收集，TLC檢識展開劑丙酮一氯(2:8)，顯色劑5%香草醛濃硫酸乙醇液
至洗脫*，相同流份合并，回收溶劑。將冬凌草甲素流份合并蒸干。加人適量甲醇熱溶后自然放置，析出結晶，為冬凌草甲素。
4、層析柱再生、平衡
有效成分經TLC檢識全部流出后，用純丙酮5000ML再生，丙酮一石油醚(5:95)平衡后，可再次上樣，反復使用(使用次數隨原料不同而異，一般可連續使用2-6個月以上)。
5、重結晶
冬凌草甲素結晶析出*后，減壓過濾，然后用少量甲醇洗滌(洗滌液保留，作下次熱溶冬凌草甲素用)。將冬凌草甲素再用適量甲醇熱溶后放置，結晶再次析出，待結晶*后，抽濾，用少量洗滌，將結晶室溫下晾干后置真空干燥箱中，35度真空干燥至恒重。密封于瓶中，置干燥器中保存。
6、薄層層析分析
取適量冬凌草甲素對照品及由上述方法得到的冬凌草甲素樣品甲醇溶解后點于同一硅膠G薄層板上，以氯一丙酮(8:2)為展開劑進行展開，5%香草醛濃硫酸乙醇液顯色，于105。C烘至斑點清晰。表明在該展開系統下，冬凌草甲素樣品和對照品都具有相同的RF值，并呈現出同樣的藍綠色斑點，在制備的冬凌草甲素樣品中，沒有雜質斑痕。
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