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太贊了!質粒提取鑒定及保存

來源:安諾倫(北京)生物科技有限公司   2021年09月06日 10:22  

(1) 質粒的提取 (Tiangen質粒提取試劑盒):

a) 挑菌: 選取培養板中大小中等的單個菌落, 消毒牙簽接種到10ml搖菌管中, 其中含有卡那霉素的LB約5ml, 37 °C, 220rpm恒溫搖床中震蕩培養過夜。

b) 取上述2.0ml培養液, 于常溫下12000 rpm離心1分鐘, 棄上清, 干燥沉淀。

c) 加入250µl溶液P1(配有去RNA酶, 4 °C保存), 渦旋振蕩, *懸浮細菌,不能留有沉淀, 否則會影響裂解。

d) 加入250µl溶液P2, 快速上下顛倒8次, 常溫靜置3分鐘, 可見混合液逐漸變清、 粘稠, 表示已充分裂解。

e) 再加入350 µl溶液Ⅲ, 快速上下顛倒8次, 可見白色絮狀物出現。

f) 常溫12000rpm離心10分鐘, 所得上清液倒入已經用BL平衡過的過濾柱中,注意不要倒入白色絮狀物沉淀, 靜置3分鐘, 12000 rpm離心1分鐘。

g) 加入500 µl溶液PD, 12000 rpm離心1分鐘。

h) 加入600 µl溶液PW, 12000 rpm離心1分鐘; 此步驟再重復1次; 棄廢液后空管再次12000 rpm離心2分鐘。

i) 于超凈臺通風干燥, 放置2-5分鐘, 加入33µl已加熱至65 °C的已滅菌的ddH 2 O, 室溫靜置3分鐘, 12000 rpm離心2分鐘, 得到相關質粒DNA, 測濃度, -20 °C保存備用。

(2) 質粒鑒定及保存

取100ng上述提取的質粒, 進行酶切(反應體系見前), 隨后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳以鑒定(方法同前所述), 最后將粗略鑒定正確的樣本送至生物技術公司測序。 如測序正確, 用50%滅菌甘油300µl+700µl的菌液, 標記于-80 °C保存備用。

11) 質粒或PCR產物純化(膠回收)

(1) 瓊脂糖電泳酶切或 PCR 相關產物。

(2) 在紫外投射反射儀割取含有目的片段的瓊脂糖凝膠片段, 割取要迅速, 以避免紫外線對 DNA 的損傷, 但注意盡量割取目的片段, 減少無目的片段的凝膠量, 以便提高純化回收效率。

(3) 用天平稱先稱區空 EP 管重量, 再稱取含有凝膠的 EP 管重量, 計算得到凝膠重量(mg), 加入等量體積(µl) Bindingbuffer(如 1 mg=1 μl)。

(4) 將含有凝膠的 EP 管置入 60 °C 恒溫水浴箱中融化凝膠, 持續 8-10min,間或拿出搖勻, 以確保*凝膠溶解。

(5) 將上述凝膠溶液轉移至干凈的純化柱上, 室溫下靜置吸附 3 分鐘。

(6) 將純化柱 12000rpm 離心 1 分鐘, 棄超濾液, 必要時可將超濾液重新離心1 次可提供純化效率; 再次加入 100µl Binding buffer, 12000rpm 離心 1 分鐘。

(7)加入 700µl Wash buffer (事先已經加入無水乙醇), 12000 rpm 離心 1 分鐘,棄超濾液; 空管 12000 rpm 離心 2 分鐘。

(8) 純化柱置于 1.5 毫升干凈離心管中, 于超凈臺通風干燥 5 分鐘。

(9) 加入 30µl 已加熱至 65 °C 的已滅菌的 ddH 2 O, 室溫靜置 3 分鐘, 12000 rpm離心 2 分鐘, 得到相應的 DNA 片段, 測濃度, -20 °C 保存備用。

艾柏森提供質粒測序服務


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