胰蛋白酶消化，質譜法輕松鑒定蛋白質，已經是非常成熟的工作流程。即使是剛接觸MS的使用者也可以很快掌握。在質譜法鑒定蛋白的工作流程中，蛋白質鑒定是通過使用搜索引擎，例如 Mascot或Matrix Science進行簡單的數據庫搜索來實現的。然而，對于數據庫中未列出的蛋白質鑒定需求，或需要進行蛋白質末端序列分析的這兩種情況，通常采用更昂貴的高端儀器和更復雜的工作流程，需要熟練的操作員。此外，蛋白質測序儀也通常用作蛋白質末端序列分析的方法，但遇到 N 端封閉的蛋白質，去封閉是必要的。作為樣品序列分析前的預處理，預處理效果取決于蛋白質類型，可能效果不佳，對操作人員有一定要求，需要一定程度的技能和經驗，這些可能會限制其使用。 

近年來，利用MALDI-TOF離子源（ISD：In-Source Decay）中發生的蛋白質碎裂離子，可以分析N末端被封閉或未在數據庫中登記的蛋白質序列MS圖譜。此外，ISD理論上不受每個樣品質量的限制，因此無需胰蛋白酶消化即可直接對高質量蛋白質進行測序。結合電泳膠提取蛋白和島津臺式機MALDI-8020，通過N端封閉蛋白的分子量測定和序列分析的例子，讓我們來了解下大蛋白分子直接測序技術MALDI-ISD。

將模型樣品N 端被乙酰化的牛碳酸酐酶 (Sigma-Aldrich)溶解在緩沖溶液中進行電泳， 95 °C 下加熱 5 分鐘，然后在聚丙烯酰胺凝膠（ATTO 12.5 %，預制 e-PAGEL）上進行電泳。所得聚丙烯酰胺凝膠用考馬斯亮藍染色以檢測蛋白質斑點。使用含有表面活性劑的提取緩沖溶液，我們從凝膠分離的碳酸酐酶的條帶中提取蛋白質。使用氯仿/甲醇在提取緩沖溶液中沉淀蛋白質以去除表面活性劑和鹽，并使用 MALDI-TOF 質譜儀進行測量。芥子酸用作 MALDI 基質用于蛋白質分子量測量，1,5-二氨基萘 (DAN) 用于 ISD 的序列分析。

圖1、碳酸酐酶電泳圖

圖2、從凝膠中提取的碳酸酐酶MS圖（基質芥子酸）

接下來，從25 pmol凝膠蛋白條帶中提取碳酸酐酶，與基質DAN混合，MALDI-8020線性模式進一步分析。結果如圖3所示，主要檢測到c離子（從蛋白質N段產生的片段）質量一致的峰。通過使用免費軟件Mass++ TM和蛋白質氨基酸序列比對工具Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)，我們對從檢測到的峰中獲得的氨基酸序列進行了同源性搜索。

圖3、MALDI-ISD鑒定結果

鑒定結果顯示匹配結果最高的是碳酸酐酶。通過檢測到的c離子片段質量和數據庫中已有的碳酸酐酶氨基酸序列，我們可以推斷出N段序列是SHHWGYGKH...，并且是N-乙酰化的。

MALDI-8020線性模式MALDI-ISD技術，無需復雜的工作流程，無需胰蛋白酶消化即可直接對高質量蛋白質（如本文所述m/z 29030示例）進行N端測序。

該方法在島津應用專家與美國佛羅里達州立大學、日本愛媛大學高級研究支持中心生物醫學分析部、利物浦大學生化與系統生物學系等共同發表的一篇文獻中也有應用到。PEPPI-MS基于聚丙烯酰胺凝膠的預分餾，實現質譜法鑒定完整蛋白或蛋白復合物。凝膠分離回收14種人血清蛋白，提取后，用MALDI-8020的MALDI-ISD產生的產物離子鑒定人血清白蛋白N端氨基酸序列。

MALDI-8020是島津MALDI家族一款體積小巧，性能優良的特色產品。榮獲2018 IBO工業設計大獎銀獎。

主要特點：

● 線性臺式MALDI-TOF

● 200Hz固態激光器，355nm波長

● 進樣速度快

● TrueClean™自動源清潔功能。配備大口徑離子光學系統，使儀器長期使用中源的污染風險降到最低。配備基于紫外激光器的源清潔功能，可自動快速實現源自清潔。

● 靜音（<55dB）

● 可視化工作狀態

參考文獻：

島津應用新聞 No.B83

J. Proteome Res. 2020, 19, 3779−3791