細菌呼吸鏈復合物3（bc-1 complex）活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

   細菌呼吸鏈復合物3（bc-1 complex）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在使用還原性合成輔酶Q同功類似物和特異性抑制劑，通過反應系統測定樣品中細胞色素C還原后峰值的增高，即采用比色法測定樣品中酶活性的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種野生、培養或病原性細菌膜蛋白懸液樣品的輔酶Q-細胞色素C還原酶的特異性活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

技術背景

細菌呼吸鏈復合物III，通常稱為輔酶Q－細胞色素C還原酶、細胞色素還原酶或bc1復合物（ubiquinol cytochrome c oxidoreductase；cytochrome reductase；bc1 complex），是細菌電子傳遞鏈的中心元素，位于革蘭氏陰性和陽性細菌（除大腸桿菌和古生菌等），包括光合成細菌的細胞膜上，為寡聚體膜蛋白復合物。細菌使用氧氣、氮、硫化物等作為終端電子受體。細菌復合物III含有三個亞單位，包括細胞色素b（Cytochrome b），細胞色素c1（cytochrome c1）和Rieske鐵硫蛋白（Rieske iron-sulfur protein），通過Q循環（Q cycle）進行催化作用。其特征性的酶活性是抗霉素敏感的輔酶Q－細胞色素C還原酶。復合物III催化氧化型細胞色素C被還原為還原型細胞色素C，細菌內電子由低電位的供體還原型泛醌（ubiquinol；UQH2）或還原型輔酶Q（reduced Coenzyme Q；CoQH₂）傳遞到細胞色素C或質體藍素（plastocyanin）上的能量轉移反應，進行呼吸鏈傳遞。細菌復合物3和復合物4的相互作用，形成泛醌氧化酶（quinol oxidase）。輔酶Q－細胞色素C還原酶反應系統測定氧化型細胞色素C的濃度變化。基于還原型泛醌或還原型輔酶Q底物，在抗霉素存在與否的情況下，通過輔酶Q-細胞色素C還原酶的催化，轉化成泛醌（ubiquinone；UQ）或輔酶Q（Coenzyme Q；CoQ），同時氧化型細胞色素C，轉化為還原型細胞色素C，在分光光度儀下產生吸光峰值的變化（550nm 波長），由此定量測定輔酶Q－細胞色素C還原酶的特異活性。其反應系統是：

產品內容

   緩沖液（Reagent A）         毫升

   反應液（Reagent B）             微升

   陰性液（Reagent C）           毫升

   底物液（Reagent D）          微升

   專性液（Reagent E）           微升

   穩定液A（Reagent F1）         管

   穩定液B（Reagent F2）         毫升

產品說明書               1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；   反應液（Reagent B）和   底物液（Reagent D），避免光照，有效保證3月

用戶自備

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

培養箱：用于孵育反應物

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；   反應液（Reagent B）和   底物液（Reagent D）注意避光。 

一、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細菌膜蛋白樣品等），置于冰槽里 

2． 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為550nm，間隔60秒，讀數3次（共2分鐘），并置零

3．    緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

4． 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的   穩定液B（Reagent F2）置入冰槽里融化，然后移出xx毫升到   穩定液A（Reagent F1）管里，混勻后，標記為   穩定工作液，置于冰槽里備用（注意，15分鐘內使用，用完后丟棄）。然后將－20℃冰箱里的試劑盒中的   反應液（Reagent B）室溫下融化，然后移出10微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升   穩定工作液，輕柔混勻后，室溫下避光靜置15分鐘（可見顏色變白），標記為   反應工作液。然后即刻進行下列操作。

二、 背景對照測定

1． 移取xx微升   緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入10微升   反應工作液 

3． 加入xx微升   底物液（Reagent D）

4． 室溫下靜置10分鐘，避免光照

5． 加入xx微升   陰性液（Reagent C）

6． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

7． 即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照：550波長讀數1分鐘或2分鐘－550波長讀數0分鐘 

三、 樣品總活性測定

1． 移取xx微升   緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入10微升   反應工作液

3． 加入xx微升   底物液（Reagent D）

4． 室溫下靜置10分鐘，避免光照

5． 加入100微升待測樣品（注意：15微克細菌膜蛋白）

6． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

7． 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：550波長讀數1分鐘或2分鐘－550波長讀數0分鐘

四、 樣品非特異活性測定

1． 移取xx微升   緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入10微升   反應工作液，避免光照

3． 加入xx微升   底物液（Reagent D）

4． 室溫下靜置10分鐘，避免光照

5． 加入xx微升   專性液（Reagent E）

6． 加入100微升待測樣品（注意：15微克細菌膜蛋白）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數：550波長讀數1分鐘或2分鐘－550波長讀數0分鐘

五、 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

2）樣品特異活性

注意事項

1． 本產品為21次操作（10個樣本），包括1次背景對照測定

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需1次

4． 如果增強酶活檢測，建議使用細菌膜蛋白樣品。推薦使用   細菌呼吸鏈復合物檢測樣品制備試劑盒－    15142

5． 每增加1個樣品，增加   反應工作液為：   反應液（Reagent B）5微升＋   穩定工作液5微升，以此類推。配制反應工作液時，須根據樣本數量配制實際工作液容量

6． 用戶可以根據實際樣品，計算   緩沖液（Reagent A）、   反應工作液和   底物液（Reagent D）三者之和，混勻后，室溫下靜置10分鐘后，即刻檢測

7． 加入樣品啟動反應后3秒內即刻比色測定

8． 分光光度計波長嚴格設置在550nm，誤差10nm將不產生信號

9． 測定可以持續2分鐘

10． 測定值由低到高變化，即2分鐘測定讀數高于0分鐘測定讀數，表明有酶活性

11． 比色測定后，比色皿須清洗*

12． 建議用戶使用分光光度儀檢測，總體系減半可以增加檢測樣本數

13． 建議待測樣本膜蛋白濃度為15微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整（本公司提供    Bradford蛋白質濃度定量試劑盒    30030.1）

14． 如果使用細菌裂解懸液，則蛋白濃度為50微克/100微升

15． 樣品特異活性是指抗霉素敏感的輔酶Q－細胞色素C還原酶，去除其它干擾因素（例如復合物I/II/IV等）

16． 細菌呼吸鏈復合物III（輔酶Q－細胞色素C還原酶）單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型泛醌（CoQH₂）所需的酶量作為一個活性單位

17． 本公司提供系列細菌酶類技術產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測準確