全組織細胞色素C氧化酶和琥珀酸脫氫酶（Combined COX-SDH）雙酶活性

染色試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

   全組織細胞色素C氧化酶和琥珀酸脫氫酶（Combined COX-SDH）雙酶活性染色試劑是一種旨在使用細胞色素C催化人工電子供體染料二氨基聯(lián)苯胺的非酶源性自然氧化，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物，以及使用合成電子受體四氮唑蘭染料，通過反應(yīng)呈現(xiàn)出藍色沉淀現(xiàn)象，來分析全組織樣品中細胞色素氧化酶和琥珀酸脫氫酶雙酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心改良傳統(tǒng)方法、成功實驗證明的。主要適用于動物組織的細胞色素氧化酶和琥珀酸脫氫酶活性的定性檢測。適宜于線粒體疾病和肌肉分型的研究。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。

技術(shù)背景

肌肉組織細胞中含有氧化酶，包括細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶和NADH四氮唑蘭還原酶（NADH-TR）等，通過組織化學(xué)染色，可以呈現(xiàn)低含量（陰性染色）和高含量（深度染色）線粒體狀況，由此分辨肌纖維類型和識別線粒體肌病（myopathy）。細胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）是氧化呼吸鏈的酶部分的總稱。其存在于真核生物的細胞線粒體上，主要通過氧化磷酸化為細胞提供能量。二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是人工電子供體染料，通過與金屬蛋白，例如含鐵蛋白細胞色素C中的物理性結(jié)合，產(chǎn)生非酶源性自然氧化，同時提供電子（細胞色素C作為電子受體）于呼吸鏈的電子傳遞系統(tǒng)，由此呈現(xiàn)出顏色變化和沉積，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物。在DAB自然氧化的同時，產(chǎn)生活性氧，例如過氧化氫，由過氧化氫酶防止其聚集。在大量氧化型DAB的存在下，通過細胞色素氧化酶的作用，亞鐵細胞色素C被氧化成正鐵細胞色素C。由此氧化型DAB棕褐色不溶性產(chǎn)物被用于檢測組織細胞中細胞色素氧化酶的活性。琥珀酸脫氫酶（succinnate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循環(huán)中與細胞線粒體膜相關(guān)的重要元素，位于線粒體內(nèi)膜，參與細胞呼吸鏈。其功能在于催化琥珀酸（succinate）的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生延胡索酸（furmarate），通過黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）傳遞電子。基于琥珀酸脫氫酶的反應(yīng)原理，使用人工電子受體染料硝基藍四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），接受來自還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（Reduced flavin Adenine Dinucleotide；FADH₂）的電子，而被還原，產(chǎn)生不溶性藍色或藍黑色甲暨色素。使用雙酶染色，可以有效地篩選線粒體疾病和進行肌纖維分型。 

產(chǎn)品內(nèi)容

   清理液（Reagent A）           XX毫升

   染色液A1（Reagent B1）          XX毫升

   染色液A2（Reagent B2）          XX管

   反應(yīng)液A（Reagent C）          XX毫升

   染色液B（Reagent D）          XX毫升

   反應(yīng)液B（Reagent E）          XX毫升

   固著液（Reagent F）           XX毫升

產(chǎn)品說明書                1份

保存方式

保存   染色液A和B（Reagent B和D）和   反應(yīng)液A和B（Reagent C和E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于工作液配制的容器

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

光學(xué)顯微鏡：用于染色后觀察分析

實驗步驟

染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取XX毫升   染色液A1（Reagent B1）到1管   染色液A2（Reagent B2）里，混勻，標(biāo)記為   染色工作液，置于冰槽里備用，避免光照（注意：有效期1周）；繼續(xù)移取XX毫升   染色工作液到新的15毫升錐形離心管，加入XX微升   反應(yīng)液A（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為   反應(yīng)工作液A，置于冰槽里，避免光照；同時移取XX毫升   染色液B（Reagent D）到新的15毫升錐形離心管，加入XX微升   反應(yīng)液B（Reagent E），混勻后，標(biāo)記為   反應(yīng)工作液B，置于冰槽里，避免光照。然后進行下列操作。

1． 準備1個6孔細胞培養(yǎng)板

2． 放進新鮮切除的動物組織樣本（注意：建議組織大小為0.5厘米厚，1厘米長；如果過大，最好刀切處理一下）

3． 將組織壓平

4． 小心加入XX毫升   清理液（Reagent A），清洗組織樣本

5． 小心抽去清理液

6． 小心加入XX毫升   反應(yīng)工作液A，浸沒整個組織

7． 放進37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘，避免光照

8． 小心抽去   反應(yīng)工作液A

9． 小心加入XX毫升   清理液（Reagent A），清洗組織樣本

10． 小心抽去清理液

11． 重復(fù)實驗步驟9至10二次

12． 小心加入XX毫升   反應(yīng)工作液B，浸沒整個組織

13． 放進37℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘，避免光照

14． 小心抽去   反應(yīng)工作液B

15． 小心加入XX毫升   清理液（Reagent A），清洗組織樣本

16． 小心抽去清理液

17． 重復(fù)實驗步驟15至16二次

18． 小心加入XX毫升   固著液（Reagent F），浸沒整個組織

19． 室溫下孵育15分鐘

20． 小心抽去   固著液（Reagent F）

21． 小心加入XX毫升   清理液（Reagent A），清洗組織樣本

22． 小心抽去清理液

23． 重復(fù)實驗步驟21至22二次

24． 后續(xù)石蠟切片（6微米厚）或冰凍切片（10微米厚）

25． 在光學(xué)顯微鏡下觀察和計數(shù)：

單純表達細胞色素氧化酶活性的組織細胞，呈現(xiàn)棕色

單純表達琥珀酸脫氫酶活性的組織細胞，呈現(xiàn)藍色

同時表達細胞色素氧化酶和琥珀酸脫氫酶活性的組織細胞，呈現(xiàn)棕藍色

注意事項

1． 本產(chǎn)品為10次操作

2． 操作時，須戴手套

3．    染色液和   反應(yīng)液避免反復(fù)凍融

4．    染色工作液不宜久存，1周內(nèi)使用為佳

5． 用戶根據(jù)實際需求，按比例配制試劑用量

6． 整個操作，在避光狀態(tài)下進行

7． 染色孵育時間，根據(jù)樣品和酶活性強弱調(diào)整

8． 全組織染色存在其染色不均勻、組織內(nèi)部染色滲透困難等局限

9． 染色后的后續(xù)處理的切片樣品可以長期保存，同樣須避免光照

10． 細胞色素C氧化酶和琥珀酸脫氫酶雙酶雙酶染色參考圖像：

11． 本公司提供系列組織細胞酶活性染色試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰