如何快速構建穩定細胞株？

如何在實驗流程上篩出高效表達的單克隆，

縮短篩選周期？

又將如何評估單克隆的穩定性？

以 Gibco ExpiCHO 培養基系統篩選穩轉細胞株為例，小編為大家簡述單克隆的篩選流程：

Gibco 培養基、補料、添加劑等，可用于常規哺乳動物細胞或昆蟲細胞的培養

1.準備載體

通過內切酶進行載體線性化處理，利用核酸提取系統和純化試劑盒進行質粒DNA提純。

賽默飛 KingFisher Flex 基于磁珠分離的高通量核酸提取設備

2.轉染細胞

轉染前利用細胞計數儀確保細胞密度控制在2*106-6*106cells/mL，細胞活力在95–99%之間。

將ExpiFectamine CHO轉染系統與質粒DNA室溫孵育1-5min后轉移到搖瓶培養系統。37℃ 8% CO2孵育兩天后測定細胞活力，細胞個數以及抗體滴度 (理想情況高于4 mg/L)。

Nalgene一次性PETG無菌搖瓶

3.篩選

以5*105cells/mL的細胞密度，在30 mL ExpiCHO表達培養基中傳代培養。搖瓶中加入G418或Puromycin等相應選擇壓力。培養第7天進行細胞計數，每3-5天傳代一次。細胞密度達到1*106 viable cells/mL，細胞活力超過85%時，階段一結束，并進行細胞凍存。從階段一獲取的細胞，將選擇壓力調整為階段一的2-5倍進行再次篩選。

4.混合細胞株生產力的評估

從階段二獲取的細胞，以5*105cells/mL的細胞密度，在125mL搖瓶中培養。分別在第0，3，5，7，10，12和14天 (建議把第零天放到周五) 取樣檢測細胞密度，活力和抗體滴度。

5.獲取單克隆

將混合細胞株按照如下稀釋比例稀釋至1000 cells/mL，利用分液器以0.5 cell/孔的密度接種至96孔板中，靜置培養。

混合細胞株的層級稀釋比例

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分液體積50納升至50微升

6.單克隆的放大培養以及篩選評估

將篩選出的單克隆從96孔板依次放大至125 mL搖瓶中培養。并進行層級篩選。

初始篩選：6孔板培養5天后，評估細胞蛋白表達，從中選取表達量較高的15-40個克隆轉移至125 mL 搖瓶中；并進行細胞液氮凍存。

二級篩選：14天簡單補料添加評估，分別在0，3，5，7，10，12和14天取樣檢測細胞密度，活力和抗體滴度；并在第3，5，7天補加葡萄糖培養。并進行細胞液氮凍存。

三級篩選：14天補料添加評估，細胞復蘇傳代2-5次后，3-14天檢測細胞培養密度、活力以及蛋白表達。每個克隆均需要有1-3個平行對照。

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7.細胞株穩定性的評估

接下來需要評估獲取的單克隆可以在多長的周期穩定表達蛋白。挑選16個單克隆，在搖瓶中傳代60次或者連續培養12周評估單克隆的穩定性。