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加菲說檢測|支原體NAT檢測方法驗證(六)

來源:上海瑋馳儀器有限公司   2021年07月30日 14:30  

近些年,生物制藥迅猛發展,法規要求“源于細胞培養的產品都必須確保無支原體污染”,制藥企業對支原體檢測越來越重視。

在快速檢測方法出現以前,傳統檢測方法時效性不足,因此只能“抓頭”和“顧尾”,但行業內在注重支原體檢測方法性的同時,對時效性的要求越來越高。如第四期所述:傳統的培養法和DNA染色法雖然有著自身的優點,但較長的檢測周期或靈敏度逐漸不能滿足行業快速發展的需求。

NAT方法從當前支原體快速檢測方法中脫穎而出,已經被美國藥典[1]、歐洲藥典[2]和日本藥典[3]收錄,并明確提到NAT方法在經過適當驗證后,可用于檢測方法補充或替代藥典方法進行放行檢測。國內的相關機構和也在這方面做了的研究工作。


雖然2020版《中國藥典》四部支原體檢查相關內容的仍然是培養法和DNA染色法,NAT方法仍未正式露面,不過一如既往 提到“也可以采用經國家藥品檢定機構認定的其他方法” [4];中檢院及相關也鼓勵研究者開發快速的支原體檢查法用于中間過程監測或放行檢測,但需證明所用快速方法的檢出限至少不能低于藥典方法 [5]。國內越來越多的企業也開始建立靈敏和的qPCR檢測方法,用于過程監控或者快速放行檢測。


法規或監管機構均要求對NAT方法進行驗證后才能用于支原體檢查,而國內暫時沒有專門的指導文件發布,因此,如何系統、有效地驗證就成為大家關注和思考的一個問題。
目前國內企業一般參考《歐洲藥典》[6]或《日本藥典》[7]NAT方法驗證部分的內容,中檢院也專門就支原體核酸檢測及方法學驗證發表文章[8] ,指出目前歐洲藥典關于支原體NAT方法驗證的內容為詳細,并作了具體闡述,可供參考。


此外,任何一種檢測方法的驗證都需要建立在方法適用性和方法優化的基礎之上。支原體檢測方法在IND階段和臨床階段沒有要求必須做到完整的驗證,但是BLA前必須做面驗證[9]

需要強調一點,不管是歐洲藥典還是日本藥典,對NAT方法驗證都有提到:標準品可以是支原體菌株也可以是支原體核酸。


個人認為, NAT方法本身就是對支原體核酸的檢測,那么做方法驗證,使用核酸作為標準品是恰當的,能反映檢測方法對核酸的檢測能力。而且支原體在不同的生長階段,不同的生長條件下,一個CFU可能包含不同數量的16S拷貝數[10],因此以基因拷貝數(GC)作為靈敏度標準,某種程度上更能體現NAT方法的優勢,比CFU作為NAT檢測靈敏度單位更不會引起誤導。同時考慮到活體支原體對實驗室的污染,選擇支原體核酸標準品進行方法學驗證也有安全性保障。
如果需要使用CFU標準品進行NAT方法學驗證,則必須清楚GC/CFU比值,監管機構 “要求” GC/CFU比值越接近1越好[11],因此標準品制備或購買時候需要考慮取樣時期或供應商選擇。
支原體檢測屬于定性檢測項目,根據歐洲藥典或日本藥典建議,驗證的內容主要包括專屬性(Specificity)、檢測靈敏度(Detection limit)和耐用性(Robustness)三個方面。
專屬
專屬性指能夠明確地檢測出樣品中存在的目標核酸的能力。專屬性的好壞主要與引物的選擇、擴增和檢測條件有關,一般建議使用已知量的基因組DNA進行專屬性測試。應包括以下兩方面的內容:

支原體核酸能夠被檢出。這一方面數據可由廠家提供證明也可以根據實際情況進行選材驗證;

非支原體DNA不會被檢出。一般選用系統發育關系比較近的革蘭氏陽性細菌來驗證,包括Clostridium(梭菌屬), Lactoacillus(乳酸菌屬)和Streptococcus(鏈球菌屬)的細菌。但是在實際操作中,也會引入宿主細胞和實驗室常使用的表達菌株DNA進行專屬性驗證,以確認細胞基質不會干擾結果判定。此外,由于支原體檢測實驗和操作環境都有的人源DNA氣溶膠存在,因此,也建議引入人源DNA進行專屬性確認,來排除檢測結果假陽性。

檢測限

測限指能夠檢測到的樣品中的The Lowest目標支原體或核酸濃度,在設定濃度情況下進行陰性/陽性確認即可,不要求定量。從統計學角度要求95%檢測孔中能夠檢測為陽性的The Lowest支原體或拷貝數濃度即檢測限。


藥典NAT方法驗證中但是不限于使用如下支原體進行方法學驗證,包含了制藥領域原輔料、操作人員等潛在污染源的代表性支原體類型。

實際驗證中,一般建議選取自己工藝中可能引入的支原體類型進行驗證即可

  • 如工藝中涉及血清使用,建議驗證精氨酸支原體和發酵支原體;

  • 如果涉及貼壁細胞培養和胰酶使用,建議驗證豬鼻支原體;

  • 如果涉及植物源原輔料,建議進行柑橘頑固病螺原體驗證;

生產工藝中人一直會參與實驗操作,因此口腔支原體、肺炎支原體和唾液支原體都建議做驗證。

對于每種支原體,需要在不同天,至少各做3個稀釋梯度的標準品,每個稀釋梯度做8個重復檢測或不同天各做 4個稀釋梯度,每個稀釋梯度做6次重復檢測,每個梯度的復孔數不低于24孔,以便統計學分析,并以95%陽性率結果進行檢測限確定。也可以進行前期摸索,確定一個大致陽性閾值點,然后在此濃度范圍附近進行檢測限確認,進而減少工作量。

耐用性

耐用性指當檢測方法參數有小的刻意變化時,檢驗結果不受影響的能力,為方法正常使用時的可靠性提供依據。耐用性的評估在方法開發階段就應該被考慮,比如試劑中Mg2+、引物和dNTP的濃度,核酸提取步驟的變動以及不同核酸擴增儀也是經常用來評估的對象。與此同時,也建議耐用性考察盡量包括樣品保存方式,以及不同人員操作數據,來盡可能的減少檢測偏差。

以上為支原體檢測方法的驗證內容。要替代藥典方法,還需要做靈敏度可比性研究,證明NAT方法的靈敏度不低于藥典現有方法,即不低于10 CFU/mL或100CFU/mL的靈敏度。有兩種方案可以用于可比性研究:


  • 核酸檢測與藥典方法平行進行,檢測并分析支原體LOD濃度情況下的檢出率;

  • 將NAT方法的數據與此前藥典方法驗證的靈敏度數據對比。此種情況下,所用標準品的標定及穩定性都需要有明確的文件支持。

對比性研究中NAT檢測也可以使用GC/mL作為LOD濃度,但是必須知道支原體CFU標準品制備時候的GC/CFU比例關系,以方便換算和檢測限對比。


此外,在實驗中還建議設置內控(Internal control)和質控對照(External control),以確認檢測過程中無PCR抑制問題,并通過靈敏度陽性對照(External positive)和陰性對照(External negative)對檢測結果有效性進行確認[7]


支原體NAT方法作為定性檢測,其驗證內容相對定量檢測方法驗證來說較為簡單。但是從實質上看,驗證復雜程度更大,而且考慮到標準品的來源、標定、保存及稀釋檢測,本身就是一項復雜工作。

但是就像前面內容所提到,支原體NAT方法本來就不能追求一次性完成,在BLA前完成完整驗證即可。而且,支原體檢測的本質是盡早盡可能靈敏的發現污染,這種檢測不是通過一次性驗證能夠完成的,這是一項持續的過程,直到工藝步驟全部鎖定。

目前為止,已經有很多企業使用MycoSEQ完成了NAT的方法驗證工作,并已經用于產品的放行檢測。因此為MycoSEQ的使用積累了寶貴的經驗和實踐基礎。













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