支原體核酸能夠被檢出。這一方面數據可由廠家提供證明也可以根據實際情況進行選材驗證；

非支原體DNA不會被檢出。一般選用系統發育關系比較近的革蘭氏陽性細菌來驗證，包括Clostridium（梭菌屬）, Lactoacillus（乳酸菌屬）和Streptococcus（鏈球菌屬）的細菌。但是在實際操作中，也會引入宿主細胞和實驗室常使用的表達菌株DNA進行專屬性驗證，以確認細胞基質不會干擾結果判定。此外，由于支原體檢測實驗和操作環境都有的人源DNA氣溶膠存在，因此，也建議引入人源DNA進行專屬性確認，來排除檢測結果假陽性。

檢測限

檢測限指能夠檢測到的樣品中的The Lowest目標支原體或核酸濃度，在設定濃度情況下進行陰性/陽性確認即可，不要求定量。從統計學角度要求95%檢測孔中能夠檢測為陽性的The Lowest支原體或拷貝數濃度即檢測限。

藥典NAT方法驗證中但是不限于使用如下支原體進行方法學驗證，包含了制藥領域原輔料、操作人員等潛在污染源的代表性支原體類型。

實際驗證中，一般建議選取自己工藝中可能引入的支原體類型進行驗證即可

• 如工藝中涉及血清使用，建議驗證精氨酸支原體和發酵支原體；

• 如果涉及貼壁細胞培養和胰酶使用，建議驗證豬鼻支原體；

• 如果涉及植物源原輔料，建議進行柑橘頑固病螺原體驗證；

生產工藝中人一直會參與實驗操作，因此口腔支原體、肺炎支原體和唾液支原體都建議做驗證。

對于每種支原體，需要在不同天，至少各做3個稀釋梯度的標準品，每個稀釋梯度做8個重復檢測或不同天各做 4個稀釋梯度，每個稀釋梯度做6次重復檢測，每個梯度的復孔數不低于24孔，以便統計學分析，并以95%陽性率結果進行檢測限確定。也可以進行前期摸索，確定一個大致陽性閾值點，然后在此濃度范圍附近進行檢測限確認，進而減少工作量。

耐用性

耐用性指當檢測方法參數有小的刻意變化時，檢驗結果不受影響的能力，為方法正常使用時的可靠性提供依據。耐用性的評估在方法開發階段就應該被考慮，比如試劑中Mg²⁺、引物和dNTP的濃度，核酸提取步驟的變動以及不同核酸擴增儀也是經常用來評估的對象。與此同時，也建議耐用性考察盡量包括樣品保存方式，以及不同人員操作數據，來盡可能的減少檢測偏差。

以上為支原體檢測方法的驗證內容。要替代藥典方法，還需要做靈敏度可比性研究，證明NAT方法的靈敏度不低于藥典現有方法，即不低于10 CFU/mL或100CFU/mL的靈敏度。有兩種方案可以用于可比性研究：

• 核酸檢測與藥典方法平行進行，檢測并分析支原體LOD濃度情況下的檢出率；

• 將NAT方法的數據與此前藥典方法驗證的靈敏度數據對比。此種情況下，所用標準品的標定及穩定性都需要有明確的文件支持。

支原體NAT方法作為定性檢測，其驗證內容相對定量檢測方法驗證來說較為簡單。但是從實質上看，驗證復雜程度更大，而且考慮到標準品的來源、標定、保存及稀釋檢測，本身就是一項復雜工作。

但是就像前面內容所提到，支原體NAT方法本來就不能追求一次性完成，在BLA前完成完整驗證即可。而且，支原體檢測的本質是盡早盡可能靈敏的發現污染，這種檢測不是通過一次性驗證能夠完成的，這是一項持續的過程，直到工藝步驟全部鎖定。

目前為止，已經有很多企業使用MycoSEQ完成了NAT的方法驗證工作，并已經用于產品的放行檢測。因此為MycoSEQ的使用積累了寶貴的經驗和實踐基礎。