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新型CRISPR-Cas9技術(shù)能實(shí)現(xiàn)完整內(nèi)源性基因的替換

來源:上海瑋馳儀器有限公司   2021年07月28日 16:26  

2020年,CRISPR/Cas9技術(shù)成功摘下諾獎桂冠,成為當(dāng)下的基因編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有強(qiáng)大的潛力,已經(jīng)在多種基因疾病上顯示出強(qiáng)大的治療效果。

 


2021年3月,Integrated DNA Technologies(埃德特生物,以下簡稱IDT)聯(lián)合美國斯坦福大學(xué)、貝勒醫(yī)學(xué)院等機(jī)構(gòu)的研究人員在學(xué)術(shù)期刊Nature Medicine(影響因子:36.130)發(fā)表重磅研究論文,利用IDT公司的Alt-R? CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)和Lonza的電轉(zhuǎn)染系統(tǒng),成功在小鼠模型中實(shí)現(xiàn)用β-珠蛋白替代α-珠蛋白來治療β-地中海貧血。
在這項(xiàng)研究中,研究人員使用LONZA 4D-Nucleofector對β-地貧來源CD34+ HSPC進(jìn)行電穿孔,然后利用AAV6作為載體將IDT公司的Cas9結(jié)合化學(xué)合成的sgRNA遞送至HSPC進(jìn)行基因編輯,在保持高度同源HBA2基因的同時(shí),將內(nèi)源性HBA1基因敲除并替換成全長HBB基因
研究結(jié)果顯示:該基因編輯策略使得β-球蛋白:α-球蛋白信使RNA和蛋白質(zhì)比率正常化,能夠產(chǎn)生功能性的成年血紅蛋白四聚體;在小鼠模型體內(nèi)回輸后,經(jīng)過基因編輯的HSPC能夠在小鼠中進(jìn)行和雙系造血重建。提示HBB替代HBA1可以作為治療β-地中海貧血的新型治療策略。
研究人員表示,這項(xiàng)研究可能是證明在Cas9介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂(DSB)下,能夠?qū)崿F(xiàn)整個內(nèi)源性基因替換。該發(fā)現(xiàn)有望能夠拓展CRISPR/Cas9的應(yīng)用范疇,以治療更多基因突變導(dǎo)致的疾病類型。
近年來,CRISPR基因編輯技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域,可以預(yù)見的是基于CRISPR的基因組編輯技術(shù)轉(zhuǎn)化為醫(yī)學(xué)應(yīng)用會對人類健康產(chǎn)生重大影響,而此技術(shù)也成為了分子生物學(xué)工具的一場革命。
但是CRISPR/Cas9目前仍然存在一些局限性,限制了CRISPR/Cas9的快速發(fā)展,例如脫靶效應(yīng)。同時(shí),傳統(tǒng)CRISPR/Cas技術(shù)在基因切割上具有強(qiáng)大的優(yōu)勢,但是在長片段DNA的靶向插入/替換上依然存在一定的挑戰(zhàn)。
為了克服這些問題,IDT公司開發(fā)了Alt-R? CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),在降低整體脫靶率的同時(shí)實(shí)現(xiàn)在目標(biāo)靶點(diǎn)的高效切割。同時(shí)在發(fā)表的研究中,顯示出這種新型的CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠?qū)㈤L片段的功能性基因插入/替換致病性基因。
Alt-R? CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)主要采用遞送核糖蛋白復(fù)合物(Ribonucleoprotein complex,RNP)的方法,RNP即Cas9蛋白和gRNA結(jié)合形成的具有編輯功能的復(fù)合物。與傳統(tǒng)CRISPR/Cas9不同的是,在IDT公司Alt-R?CRISPR 系統(tǒng)中,gRNA的組成成分crRNA和tracrRNA均經(jīng)過優(yōu)化。
事實(shí)上,在2018年發(fā)表于期刊Nature Medicine上的另一篇研究文獻(xiàn)中,證實(shí)了Alt-R? CRISPR/Cas9的性能。在該研究中,IDT公司的 Alt-R? S.P. HiFi Cas9呈現(xiàn)出穩(wěn)定的中靶編輯活性,脫靶率極低。

研究顯示:HiFi Cas9/AAV6能夠在5個治療位點(diǎn)(HBB、IL2RG、CCR5、HEXB、TRAC)誘導(dǎo)強(qiáng)大的基因編輯,具有高靶向性;同時(shí)HiFi Cas9/AAV6介導(dǎo)鐮狀細(xì)胞疾病(SCD)患者HSPC中p.E6V突變的高水平校正。
在以上研究中,均采用到IDT公司的Alt-R產(chǎn)品,幫助客戶更好的完成研究。在基因編輯領(lǐng)域,IDT公司能夠根據(jù)客戶的不同需求,提供相對應(yīng)的Alt-R CRISPR設(shè)計(jì)方案。
根據(jù)客戶的需求設(shè)計(jì)不同的引導(dǎo)RNA:Cas9 crRNA:tracrRNA、Cas9 sgRNA、Cas12a crRNA;一系列的Alt-R CRISPR Cas酶包括WT Cas9 、HiFi Cas9 、Cas9 nickases、Cas12a (Cpf1)、Cas12a (Cpf1) Ultra;以及Alt-R電穿孔增強(qiáng)劑。IDT公司還能提供一系列Alt-R HR試劑。
通過化學(xué)合成的高度定制化的引導(dǎo)RNA(gRNA)序列,配套使用的電轉(zhuǎn)/敲入增強(qiáng)子,各類對照試劑以及免費(fèi)使用的序列設(shè)計(jì)工具,實(shí)現(xiàn)了從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到結(jié)果分析的全流程覆蓋,實(shí)現(xiàn)高效的基因編輯,讓實(shí)驗(yàn)不再困難。 
Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) 是丹納赫集團(tuán)(Danaher Corporation,紐約證交所代碼:DHR)生命科學(xué)平臺旗下的一家運(yùn)營公司。IDT于面向生命科學(xué)界開發(fā)、生產(chǎn)并銷售核酸產(chǎn)品,為學(xué)術(shù)與商業(yè)研究、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域提供支持。IDT 開發(fā)了多項(xiàng)針對基因組應(yīng)用的技術(shù),涵蓋二代測序、CRISPR基因組編輯、合成生物學(xué)、數(shù)字PCR以及RNA干擾。通過GMP服務(wù),IDT生產(chǎn)的產(chǎn)品被科學(xué)家用于研究多種形式的癌癥以及各類遺傳性和傳染性疾病,為超過130,000名生命科學(xué)研究人員提供服務(wù)。
CRISPR技術(shù)作為除ZFN和TALEN技術(shù)外另一種有效的位點(diǎn)特異性基因組修飾的工具。而如何將CRISPR系統(tǒng)高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)到目的細(xì)胞中,成了另一個亟待解決的問題。Lonza的Nucleofector技術(shù)已有20年的歷史,自2001年問世以來得到廣泛的客戶認(rèn)可,已經(jīng)被證明可作為基于CRISPR的基因組編輯工具的有效非病毒轉(zhuǎn)染方式。Nucleofector技術(shù)使用預(yù)優(yōu)化的電轉(zhuǎn)參數(shù)和細(xì)胞類型特異性電轉(zhuǎn)液的組合,以使得底物能夠直接轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核中。與傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)相比,直接轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核中,與細(xì)胞分裂無關(guān),即使在非分裂的原代細(xì)胞中也具有較高的轉(zhuǎn)染效率。Nucleofector技術(shù)按照模塊化將小體積轉(zhuǎn)染及大體積轉(zhuǎn)染,可以實(shí)現(xiàn)在小體積到大體積的線性放大,適用于從藥物研發(fā)階段到臨床階段的轉(zhuǎn)化。
Lonza總部位于瑞士巴塞爾,是全球制藥、生物技術(shù)與營養(yǎng)市場的合作伙伴。Lonza于疾病預(yù)防,并通過助力客戶推出創(chuàng)新藥物輔助治療一系列的疾病,促進(jìn)世界更健康。Lonza將生產(chǎn)制造、科學(xué)技術(shù)、工藝與技術(shù)洞察力結(jié)合以達(dá)成目標(biāo),幫助客戶在醫(yī)療健康領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)新成果實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。
Lonza為眾多的客戶服務(wù),從大型生物技術(shù)和制藥公司,到學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)及政府部門,為其提供臨床前期、臨床期到商業(yè)化階段的生產(chǎn)服務(wù),同時(shí)也為其提供創(chuàng)新性研究工具,以及全程支持產(chǎn)品商業(yè)化道路的解決方案,涵蓋了細(xì)胞基因治療、抗體藥、疫苗等領(lǐng)域的研發(fā)和生產(chǎn)。










 

 

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