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反相色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20μm（5~10&μm），取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。
反相色譜柱的影響因素：
(1)柱長
有機(jī)小分子和肽類的分辨率隨柱長的增加而增加．但是柱長增加并不能使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加．它們在較短的柱子上往往也有很好的分離效果。
(2)流動相的流速。
有機(jī)小分子和肽類的分辨率對流動相流速非常敏感。而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小，柱子越長，色譜峰的寬度就越大，分辨率就越小。制備色譜上樣過程中的流速對動態(tài)吸附容量影響很大。
(3)溫度。
溫度上升，流動相黏度下降，流動速度加快，且流動相與固定相之間的傳質(zhì)速度加快，使分辨率增加。同時，溫度上升，分子熱運(yùn)動增加，疏水性作用減弱。升高溫度要考慮目標(biāo)物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。
(4)流動相組成。
流動相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大，洗脫時間越短。RPC多采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。水是極性zui強(qiáng)的溶劑，在反相色譜中常常和基礎(chǔ)溶劑配合使用，向流動相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑，以得到不同強(qiáng)度的流動相，這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中zui常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈。此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。有機(jī)溶劑梯度的大小也會影響分辨率，一般梯度越小．分辨率越大。
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